蛋白质的修饰和表达03课件

2019/3/26,1,第三章 蛋白质的修饰和表达,2019/3/26,2,主要内容,第一节 蛋白质修饰的化学途径(P88-94 自学) 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达,2019/3/26,3,第二节 蛋白质改造的分子生物学途径,基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 分类： 位点特异性突变 基因突变技术 （按特点划分） 随机突变,2019/3/26,4,1)通过寡核苷酸介导的基因突变 位点特异性突变 2)盒式突变或片段取代突变 3)以双链DNA为模板，利用PCR 技术进行的基因突变 可以这样说，PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。,2019/3/26,5,1编码基因的专一性位点突变,定义：专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出现后变得更高效。 (1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法,2019/3/26,6,(1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素,DNA模板的制备 对于单链DNA模板一定要高纯度，即使少量的RNA分子都会影响突变的特异性。,双链DNA：一般制备DNA质粒 的方法均可,单链DNA：通过M13噬菌体或 噬菌粒来制备,2019/3/26,9,2019/3/26,10,2019/3/26,11,2019/3/26,12,2019/3/26,13,核甘酸突变引物与模板DNA的退火和引物延伸条件,对于突变引物与模板DNA的比率 一般是双引物与模板之间的摩尔比在1050：1之间。 退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。 原则：退火温度为理论预测的Tm值以上20，然后再慢慢冷却至较低温度，形成双链。 引物延伸 加入延伸所需的dNTP、ATP、DNA聚合酶、DNA连接酶等。在适当温度下进行215h的连接。,2019/3/26,14,DNA聚合酶的选择,T4DNA聚合酶 T7DNA聚合酶 Klenow酶 在单引物的延伸反应中，避免使用不当的酶引起引物置换，导致突变效率降低。,2019/3/26,15,dNTP（脱氧核苷三磷酸）对立体DNA合成的影响,dNTP纯度要高 dCTP氧化脱氨可以产生微量dUTP，当多核苷酸中搀入UMP时，受体菌中的尿嘧啶-N-糖基化酶可在U的位置切断DNA链，而细胞内的DNA聚合酶能够产生切口平移，从而降低突变体的产率。,2019/3/26,16,受体细胞对突变体产率的影响,大肠杆菌细胞内的几个错配修复系统 解决方案：采用错配修复系统缺失的系统菌株作为受体菌。 当用M13作为克隆载体时，M13可能会出现不对称复制，如果突变链复制率较低就影响试验结果,2019/3/26,17,(2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法, Kunkel 突变法 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变,2019/3/26,18, Kunkel 突变法,Kunkel 1985年建立的方法：,2019/3/26,19,具体步骤：,将待突变的基因克隆入M13 DNA载体上，导入具有dUTP酶（dut）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ung）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株中。 Dut缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后进行DNA定点突变。 双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基。 结果原来的M13模板链被降解，只有突变链因不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。,2019/3/26,20, 基于抗生素抗性“回复”的突变方法,2019/3/26,21, 基于去除特定限制酶切位点的突变,2019/3/26,22,2019/3/26,23, 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变,5端或3端区产生突变直接PCR 中心区突变重叠延伸（overlap extension） 新概念：Gene SOEing:即通过重叠延伸进行剪接（splicing by overlap extension）,也就是说通过重组延伸方法将不同的基因进行剪接和组合在一起。,2019/3/26,24,DNA片段的剪切,2019/3/26,25,取代突变,2019/3/26,26,插入突变,2019/3/26,27,缺失突变,2019/3/26,28,2区域性定向突变,基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。 常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片段取代法(DNA fragment replacement)。 这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。,2019/3/26,29,研究目的,通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构-功能之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基酸序列来置换。 盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。,2019/3/26,30,二、基因融合和基因剪接,1利用基因融合技术表达外源基因的缘由 2基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体 3蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接,2019/3/26,31,1利用基因融合技术表达外源基因的缘由,外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解 通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白，利于快速回收、纯化 融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白 通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细胞内形成包涵体 基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的研究,2019/3/26,32,21 基因融合的策略,将重组基因直接剪接于适当的信号肽之后 将外源基因本身按阅读框架自我融合。对一些小肽的稳定表达、表达产物的活性非常重要 目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的C端或N端融合,2019/3/26,33,分泌亲和融合。即：信号肽融合蛋白目标基因 双亲和融合法。即将目标基因与两个不同配基有特异亲和的异源或载体蛋白融合 分泌插入融合法。此法是将目标基因插入到信号肽序列和一插入序列之间，此插入序列是一种插入到细胞膜或细胞壁的蛋白编码 设计目的：用以将受体或抗原定位于细胞的外表面或装配成融合蛋白进入类病毒颗粒，利于开发疫苗，或产生具有免疫原的复合物,21 基因融合的策略,2019/3/26,34,2.2 产生蛋白质分子嵌合体的策略,通过限制性内切酶位点连接 条件：两个蛋白质之间有相同的限制性内切酶位点 通过缺失突变的方法连接 条件：两个蛋白质之间有相同的额外的碱基序列 通过PCR双侧重叠延伸法 该法可以在不需要分子间具有相容的限制性内切酶位点，将两个编码不同蛋白质的DNA分子重组，形成DNA分子嵌合体,2019/3/26,35,2019/3/26,36,3蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接,1990年Saccharomydes cerevisiae发现在腺苷三磷酸核苷酸酶中蛋白质会发生自我剪接（protein splicing），从而首次发现第一个蛋白质内含子Sce VMA 蛋白质内含子(intein)是蛋白质中的一段多肽链, 它靠自我剪切的方式从前体蛋白中分离出来, 而两端的外显子以肽键的方式相连,2019/3/26,37,基因融合的用途,上述这些基因融合策略，主要是有利于： 外源基因的表达 表达产物的分离 纯化以及细胞定位 作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。,2019/3/26,38,第三节 重组蛋白质的表达,重组蛋白质在大肠杆菌中的表达 重组蛋白质在酵母细胞中的表达 重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达,2019/3/26,39,一、大肠杆菌中表达体系的优点,大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。 利用大肠杆菌作为表达体系的优点： 1）遗传学和生理学背景清楚； 2）容易培养，特别是高密度发酵； 3）外源基因经常可以达到高效表达。,2019/3/26,40,大肠杆菌表达体系的缺点,大肠杆菌系统最大的不足之处是： （1）不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等； （2）广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。 （3）外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体； （4）而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。 最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，（5）有时不能得到足够的产物。,2019/3/26,41,大肠杆菌表达体系的应用,当外源蛋白质的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子内的二硫键少于34个，以及不需要翻译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。,2019/3/26,42,1表达载体的一般特点,(1) 复制起始点 (2) 选择性基因 (3) 强的、可诱导的启动子 (4) 强的转录终止序列 (5) 核糖体结合位点 (6) 合适的多克隆位点,2019/3/26,43,(1) 复制起始点,绝大多数载体利用pBR322或pUC质粒来源的复制起始点（如，pET28系列） 复制起始点决定了细胞内质粒的拷贝数 pBR322或pUC质粒来源的质粒可保持2050个拷贝数和150200个拷贝数,2019/3/26,44,(2) 选择性基因,载体上要含有至少一个选择性基因 作用： 1）保证对转化体的筛选 2）保证在培养过程中受体细胞质粒不丢失 种类：,2019/3/26,45,(3) 强的、可诱导的启动子,原核细胞的启动子包括了RNA聚合酶的识别位点和结合位点 启动子序列通常包含了10区（TATAAT）和35区（TTGACA） 常用的种类：LacUV5、trp、tac、trc以及T7启动子,RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶识别位点,2019/3/26,46,(4) 强的转录终止序列,为使目标基因有效的转录，需要满足两个条件： 转录终止序列 抗转录终止序列,减少不必需的转录通过复制起始位点，其作用可以帮助稳定mRNA，增加mRNA的半衰期,保证目标基因完全被转录,2019/3/26,47,(5) 核糖体结合位点,位置：位于启动子下游，翻译起始密码ATG的上游 核糖体结合位点SD序列，对原核细胞mRNA翻译起始非常关键,2019/3/26,48,(6) 合适的多克隆位点,将目标基因插入到表达载体上 用于构建或改造载体,2019/3/26,49,2与外源基因有效表达的相关因素,(1) 有效的转录起始 (2) 有效的翻译 (3) 蛋白质水解作用 (4) 蛋白质的外泌,2019/3/26,50,(1) 有效的转录起始,转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤 高效表达的载体包含： 1）启动子的强弱 2）调控序列,2019/3/26,51,(2) 有效的翻译,mRNA的稳定性 翻译起始的频率 肽链延伸 和终止的速率 翻译的忠实性,mRNA转录速率越高 mRNA降解速率越低,高,核糖体结合位点（SD序列） SD序列与起始密码之间的距离 起始密码上游区的序列 SD序列与可翻译序列5端形成的二级结构,遗传密码的使用（高频或低频）等 多加入终止密码子（串联终止子）,错误氨基酸的搀入,2019/3/26,52,(3) 蛋白质水解作用,合成后的蛋白质在各种蛋白酶和肽酶作用下加工 特异蛋白水解加工：主要有两种类型，一类是信号肽酶I（Lep）或信号肽酶II（Lsp）将分泌（或外运）蛋白质上的信号肽切除；一类是对存在于N末端的甲硫氨酸进行加工 蛋白质的降解 大肠杆菌内不同的蛋白水解酶和肽酶,2019/3/26,53,(4) 蛋白质的外泌,外源蛋白质与细菌细胞的外泌系统相容，可以穿过细胞质膜进入周质，这一过程称为外泌（export） 分泌（secretion）是指蛋白产物被外运到细胞之外 蛋白质外泌的优点： 格兰氏阴性菌的周质中的内环境比细胞周质内氧化性要强，利于含二硫键蛋白质的正确折叠 从细胞质中外运到周质中克服了毒性蛋白质对细胞的损害，如水解酶和DNA结合蛋白 通过信号肽酶加工，使外源蛋白有正确的N端 蛋白的外泌，特别是分泌到培养基中，便于纯化,2019/3/26,54,3改善表达水平的方法,诱导条件 外源基因的编码序列 用蛋白酶缺失的宿主菌,2019/3/26,55,诱导条件,诱导时间（常用） 诱导温度（常用） 培养基组成,2019/3/26,56,外源基因的编码序列,利用密码简并原理，改变编码区的核甘酸序列而不改变氨基酸序列，使目标基因的前几个密码子中的G/C变为A/T 用优先使用的密码子代替罕用密码子 通过改变核甘酸序列减少翻译起始区mRNA的二级结构 利用高表达识别罕用密码的tRNA质粒 尽量避免使用那些可能引起翻译问题的密码子,2019/3/26,57,用蛋白酶缺失的宿主菌,避免细胞内的蛋白酶分解产生的蛋白质,2019/3/26,58,4. 改善外源蛋白溶解性的方法, 外源蛋白的分泌表达 细菌生长温度 外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达 外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合,2019/3/26,59,三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达,1选择哺乳动物细胞表达体系的优点 2两个主要的哺乳动物细胞表达系统,2019/3/26,60,1哺乳动物细胞表达体系的优点,哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。 哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。 实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。,2019/3/26,61,分泌型哺乳动物细胞表达系统,哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分