HBV-DNAPCR检测规程.doc

HBV-DNA PCR检测规程文件编号：SZGL-C005-00 版本：00 修订次数：00 末次修（制）订日期：200308221目的规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。2范围本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）3试剂中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒4仪器Roche LightCycler荧光PCR检测仪高速台式冷冻离心机微量加样器（覆盖1-1000l）5样品处理样品处理按PCR实验室标本处理规程进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。6测定6.1 PCR扩增6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。6.1.3 将循环条件设定为：程序循环温度保持时间11次932分钟240次935秒5745秒31次400秒6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。6.2 产物分析6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。点击Quantification读取结果。6.2.2 基线的确定：取38个循环的荧光信号。6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值-0.97，接近-1.0。6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。7 结果判断7.1 如果Ct值40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）1103。7.2 如果Ct值40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml） M 7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。8注意事项8.1 各标本沸水浴时间误差不超过1分钟。8.2 加样时每加完一个要立即盖上封闭好离心管。9支持性文件9.1 乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒操作说明书8.2 临床基因扩增检验实验室工作规范10质量记录附录1：HBV项目标本采集、运送流程图医生填好申请单护士抽取清晨空腹静脉血2-3ml放至无菌的一次性无抗凝剂试管中，整个过程须注意勿溶血，管和验单均写上患者名字、盖好管盖。立即送检如延误，存放于-20冰箱保存，保存期为6个月实验室接收标本合格标本有疑问标本不合格咨询临床通知临床重采样，并登记标本合格标本不合格登记、接收注意手及其它外物勿接触到血或管、盖内壁标本运送用0冰壶附录2：HBV样本处理流程图将血清标本6,000rpm.离心20s吸取上层血清40ul加入40ulDNA提取液上机扩增充分振荡充分混匀插入圆形卡盘倒置10秒100沸水浴10min10,000rpm离心5min4充分裂解6-8小时转置反应管6,000rpm离心20秒取上清2ul点样阳性标准品(1108基因拷贝/ml)6,000rmp离心数秒阳性标准品的稀释及处理：以下步骤同标本处理加40