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流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定 7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： 淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0109/L之间。若10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核 细胞。 4溶血样本不能用。试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果 报告百分数（和绝对值）操作性能 精密度 批内五次重复CV10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核 细胞。 4溶血样本不能用。试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITCIgG1-PE)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)洗、离心、上机测样（备注： 测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果 报告阴阳性操作性能 精密度 批内五次重复CV2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值 阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。 临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。方案（Protocol） CD55/CD59测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： CD55/CD59测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3溶血样本不能用。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备:(一)白细胞CD55CD59检测1准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品100ul。2溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）3离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。4洗涤离心 5上机测样(二)红细胞CD55CD59检测 1准备2支流式细胞仪专用管，分别标记 2分别加入CD55CD59 10ul和相应的同型对照10ul。 3向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。 4洗涤离心。5混匀、上机测样。 报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV97% CD5997% PNH的临界值：RBC CD5995% WBC CD5990% PNH的诊断值：RBC CD5991% 大部分80% 中性粒细胞CD5984% 临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。方案（Protocol） 血小板膜表面抗体测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共2页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： 血小板膜表面抗体测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。 3样本血小板计数应在150-450109/L之间。若450109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若150109/L，应多采集进行富集达到流式检测的细胞数。 4溶血样本不能用。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 联科成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 富集血小板法：1）800r/min*15min,取上清，2）加45ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。3)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)4)分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小板若在正常范围，稀释到原量直接取10u1。）。5)混匀，避光，室温孵育20-30分钟6)洗或不洗，上机测样全血法：1）加45ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）6）报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值 IgA2.98% IgG3.04% IgM3.0% IgD2.91% 临床意义为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。方案（Protocol） 红细胞抗体测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共2页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： 红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3溶血样本不能用。试剂 品牌 剂型 规格 贮存 联科成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血（1：200稀释后）。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)上机测样报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值 IgA2.78% IgG2.98% IgM2.52% IgD10.0109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。 4溶血样本不能用。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 联科成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 1) 溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）2)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)2)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟，洗涤离心4)上机测样报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值 IgA2.68% IgG2.66% IgM2.49% IgD10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核 细胞。4溶血样本不能用。试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：IntraPrep Permeabilization Reagent 成分1（固定剂） 液体 5ml 室温 成分2（透膜剂） 液体 5ml 室温4：鞘液 液体 20L 室温 5：清洗液 液体 5L 室温 6：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作-样本制备： 细胞膜表面抗原1首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。2首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。3然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)4各管中加入标本(骨髓或外周血)30100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光2030分钟。5溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）细胞浆和核抗原1准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。2首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。3每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。4各管中加入PBS4ml。5300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min)6各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。 7加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。8各管中加入4mlPBS，振荡混匀。9300g离心5分钟后，弃去上清液。10各管中加入PBS500ul，振荡混匀。11上机测样报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值 CD34+5% MPO+5% 粒系20% 淋系10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核 细胞。 4溶血样本不能用。试剂 淋巴细胞培养体系(自配) 成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 选白美国SIGMA公司。 单克隆抗体 CD4PC5、IL-4-PE、IFN-FITC选自美国BeckmanCoulter公司。 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 细胞培养与染色 取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5C02 37孵育18小时，取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。流式细胞仪测定 打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-FITC的