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RPHPLC法测定阿魏酸衍生物的含量测定的方法论文 阿魏酸衍生物（BL）是对阿魏酸（Ferulic Acid，4-羟基-3-甲氧基肉桂酸）苯环进行改造后的化合物，是一个良好的抗氧化剂。文献报道其清除自由基的能力比阿魏酸明显增强。BL结构中溴原子的引入，不仅提高了清除自由基的能力，还明显增大了脂溶性，这有利于其在生物体内的转运与吸收。本文参照文献3-6建立了反相高效液相色谱方法，用于测定BL含量及其有关物质，为其质量的可控奠定基础。 1 仪器与试剂 Waters 600-717-996高效液相色谱仪（二元泵，二极管阵列检测器，自动进样器，Millennium32色谱工作站）；电子分析天平（Sartorius，BP211D）；KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；甲醇（色谱纯，禹王试剂）；乙酸（分析纯，国药集团）；水（娃哈哈纯净水）；30%H2O2（分析纯，国药集团）；盐酸（分析纯，国药集团）；氢氧化钠（纯度：96.0%，西陇化工有限公司）；BL对照品（批号：20121101纯度：99.91%，由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供）；BL供试品（由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供，批号分别为20130201，20130202，20130203）。 2 色谱条件与系统适用性试验 采用Agilent Eclipse C18（250mm4.6mm，5?m）色谱柱；流动相：甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V）；紫外检测器检测波长228nm；流速1.0mLmin-1；进样量20?L；柱温：40。理论塔板数以BL计算不低于5000，分离度大于1.5，色谱图见图1（主峰保留时间：14.5min，杂质1保留时间：5.8min，杂质2保留时间：12.8min，杂质3保留时间：38.8min）。 3 溶液的配制 3.1 对照品溶液 取BL对照品约10mg，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。 3.2 供试品溶液 取BL供试品约10mg，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 4 方法专属性考察 分别精密称取BL供试品约20mg，置3个25mL棕色量瓶中，加甲醇适量，超声助溶，进行如下破坏试验：酸破坏：加1molL-1盐酸1mL，室温下静置17h，用1molL-1氢氧化钠中和，加甲醇稀释至刻度，摇匀；碱破坏：加1molL-1氢氧化钠4mL，室温下静置65h，85水浴2.5h，冷却至室温，用1molL-1盐酸中和，加甲醇稀释至刻度，摇匀；氧化破坏：加30%双氧水8mL，室温下静置62h，85水浴2.5h，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀。 按照“2”项下的色谱条件，分别取各破坏溶液20?L进样，记录色谱图，见图2。 通过破坏试验可以看出BL 在碱、氧化条件下比较稳定，放置期间有关物质略有增加，在酸性条件下极不稳定，有关物质增加明显，但有关物质均与主峰分离良好，不干扰样品测定，说明该方法专属性好。 5 方法学考察 5.1 线性关系考察 精密称取BL对照品（批号：20121101）约4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分别置于50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶并稀释成约0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度对照品溶液。分别取上述溶液20?L进样测定，记录色谱图。以峰面积A对浓度C（mgmL-1）进行线性回归，得回归方程 A=84486C-327332（r = 0.9996），表明BL在0.080.32mgmL-1浓度范围内呈良好线性关系。 5.2 仪器精密度试验 取浓度为0.20mg/mL对照品溶液，连续进样6次，每次20?L，以峰面积计算，所得RSD为0.57%（n=6），表明测定时的仪器精密度良好。 5.3 重复性试验 取同一批号的BL供试品按“3.2”项下方法操作，配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3个浓度的标准溶液，每个浓度平行配制3份，共9份，照“2”项下色谱条件测定，按外标法以峰面积计算样品含量，测得平均含量为100.35%，RSD为0.50%（n=9），表明方法重复性良好。 5.4 稳定性试验 取室温下放置的低、中、高3个浓度的供试品溶液，各取20?L在0，4，6，8，10，12h的条件下，按照“2”项下色谱条件测定峰面积，测得RSD分别为1.7%、1.4%、1.3%，表明供试品溶液在12h内稳定。 5.5 检测限与定量限 精密吸取“3.1”项下对照品溶液，加甲醇逐级稀释，进样，记录色谱图，在信噪比（S/N）为3：1时测得检测限为8ng，在信噪比（S/N）为10：1时测得的定量限为36ng。 6 样品含量测定 按“3”项下的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液，各取20?L进样，按外标法以峰面积计算样品含量，结果表明，3批样品含量均在99.0%以上（见表1）。 7 有关物质测定 取BL供试品约20mg，精密称定，置25mL棕色量瓶中，加甲醇适量，超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得0.80mg/mL的溶液作为供试品溶液。精密移取此溶液适量，用甲醇稀释100倍，得自身对照溶液。以不加校正因子主成分自身对照法计算有关物质的含量。结果表明，有关物质均在1%以内（见表1）。 8 讨论 8.1 波长的选择 取BL对照品溶液进行紫外扫描显示其最大吸收波长在228nm和317nm处，其中228nm处的吸收值最高，因此选择228nm用于BL的含量测定，保证测定时有较高的灵敏度。 8.2 柱温的选择 考察了25、30、40的不同柱温下对样品分离效果的影响，实验表明，采用40的柱温，可减小流动相粘度、降低柱压、缩短出峰时间并改善分离效果，故将柱温定为40。 8.3 流动相的选择 根据BL的化学性质，考虑采用酸性流动相可以获得较好效果。经过实验比较采用甲醇-乙酸-水系统作为流动相，并且变换流动相比例和乙酸浓度，最终确定流动相为甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V），此条件下分离效果最好，保留时间适中。 8.4 稳定性考察 由于BL的结构特性，通常在溶液中不稳定，且见光易分解8-9，考察了BL溶液在透明量瓶和棕色量瓶中的稳定性，发现BL溶液在透明量瓶放置8小时后含量显著降低，而在棕色量瓶中的放置12小时含量变化不大，RSD小于2.0%，但是随着时间增长含量仍会缓慢降低。故在试验过程中需采取避光措施，并于配制后尽快使用。 8.5 结论 综上所述，本方法操作简便且检测限、定量限、精密度、重复性等均符合要求，故本法适用于对BL含量及其有关物质进行测定，对于BL的质量控制和使用安全有着十分重要的意义。 参 考 文 献 徐敬侠，张首国，王林，等.5-溴阿魏酸的合成研究 J.化学试剂，2012，34（5） ：463-466. 黄华永，张鲁勉，郑锦鸿.5-溴阿魏酸的合成及其清除自由基研究 J.汕头大学医学院学报，2005，18（3） ： 129-131. 李全斌，何开勇，吴建萍.阿魏酸含量测定方法研究进展J.中医药导报，2011，17（3）： 117-119. 黄罗生，郭健新，刘咏梅，等.HPLC测定阿魏酸含量的探讨J.中成药，2004，26（2）： 134-136. 何玲玲.高效液相色谱法测定当归养血丸中阿魏酸含量J.中国医药导报，2011，8（3）： 60-62. 顾民，张亮，张正行.HPLC测定逍遥散及当归中阿魏酸的含量J.中成药，