快速测定半胱氨酸含量方法的研究.doc

毕 业 论 文2014届快速测定半胱氨酸含量方法的研究 学生姓名 卓芸芸 学 号 10114339 系 别 化学化工学院 专业班级 药学102 指导教师 边可君 完成日期 2014年5月16日 14快速测定半胱氨酸的含量方法研究 摘 要钙黄绿素是一种具有荧光性的物质，在pH 8.0 的KH2PO4-NaOH 缓冲液中，Cu( ) 与钙黄绿素配位引起荧光猝灭。由于半胱氨酸与Cu( ) 的亲和力较强，可从钙黄绿素-Cu( ) 的络合物中夺取Cu( ) 而使钙黄绿素游离出来，从而使体系的荧光得以恢复，并且荧光恢复的程度与加入半胱氨酸的量在一定范围内呈线性，从而可以测定半胱氨酸的含量。本实验在钙黄绿素与铜离子 1:1，体系时间30min后，激发光谱493nm，发射光谱510nm下进行测定，该法的回归线性方程为：y=22.475x-64.1 r为：0.34% 回收率为：101.9%。 关键词 半胱氨酸；钙黄绿素-铜配合物；荧光光度分析方法Study on the method of rapid determination of cysteine contentABSTRACTCalcein is a fluorescent substance, KH2PO4 - NaOH in pH 8.0 buffer, Cu () and calcein ligand fluorescence quenching.Due to cysteine and Cu () affinity is very strong, can from the calcein - Cu () win Cu complex () and make the calcein freed,So that the system of fluorescence was restored, and the degree of fluorescence restoration and the quantity of adding cysteine in a certain range is linear.So that it can determine the content of cysteine.This experiment in the calcein with copper ions 1:1,System time after 30 min,Excitation spectrum 493 nm,Emission spectrum determination under 510nm,The method for the return of the linear equation :y=22.45x-63.6, r:0.34%,The recovery rate of:101.9%.KEY WORDS cysteine ; Calcein - copper complexes ; Fluorescent photometric analysis method 目 录摘 要IABSTRACTII目 录III1绪论11.1常见的测定方法11.1.1 HPLC法测定半胱氨酸的含量11.1.2 分光光度法测定半胱氨酸的含量12 实验部分52.1 仪器、药品、试剂52.2 实验步骤52.2.1 储备溶液配制52.2.2 体系的激发和发射光谱52.2.3.钙黄绿素及铜离子浓度比对荧光强度的影响62.2.4缓冲溶液pH对荧光强度的影响62.2.5反应时间对荧光强度的影响62.2.6 标准曲线的绘制及线性关系考察62.2.7 精密度实验72.2.7 回收率实验72.2.8 样品半胱氨酸含量的测定73 实验结果与讨论73.1 磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液的配制73.2.2 缓冲溶液pH对荧光强度的影响93.2.3 反应时间对荧光强度的影响103.2.4 半胱氨酸标准曲线113.2.5 钙黄绿素及铜离子浓度比的选择123.2.7 回收率的测定133.2.8 样品溶液的测定144 结论14致 谢171绪论 半胱氨酸为含硫氨基酸，结构式HSCH2CH (NH2 ) COOH，半胱氨酸含有巯基(- SH) ，胱氨酸含有二硫键(- S- S- ) ，二者可以相互转变，蛋白质中两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键对维持蛋白质的结构具有重要作用1，基于其独特的结构，在动物体内起着营养和免疫相关的重要生理功能。此外，半胱氨酸有刺激前T 淋巴细胞分化为成熟的淋巴细胞的作用及增加人体对某些毒素的抵抗力。 目前国内外检测半胱氨酸的方法有很多，已报道的测定半胱氨酸的方法有电化学法2、流动注射化学发光法3、催化动力学分光光度法4、旋光度法5、高效液相色谱法6及荧光分光光度法7等。1.1常见的测定方法 1.1.1 HPLC法测定半胱氨酸的含量 高效液相色谱也叫高压液相色谱，是在经典液相色谱法的基础上发展起来的，它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高效性，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故具有分析速度快的优点。 王洋等8采用高效液相色谱法来测定蛋白质粉中L-半胱氨酸的含量。采用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，流动相为0.1磷酸（pH2.05）-乙腈（80 20），检测波长为210 n m，流速为0.6 m Lmin1，柱温为室温。结果：L-半胱氨酸检测浓度线性范围为0.021.0 mgm L1（r0.9990），平均回收率为98.76，RSD1.82，检测限为0.01 mgm L1（S/N3）。本方法操作简便，结果准确可靠，重复性好，可用于蛋白质粉中L-半胱氨酸的含量测定。1.1.2 分光光度法测定半胱氨酸的含量 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。1.1.2.1 以Cu2+为探针-分光光度法测定半胱氨酸的含量9在pH4.0的乙酸盐缓冲溶液中，半胱氨酸中的巯基（SH）能使Cu2+还原成Cu+，生成的Cu+与SCN-反应生成CuSCN沉淀，所得Cu2+的量为定量生成CuSCN沉淀后留存的过量Cu2+的量，将此Cu2+的测定值间接换算成试样中半胱氨酸的含量。溶液的吸光度和半胱氨酸的质量浓度在在一定范围之间呈线性关系。1.1.2.2 以钴离子为探针-分光光度法测定半胱氨酸的含量10由于Co2+的高自旋态和有色性，作为生物体系中光谱探针是非常有利的。在NH4Cl-NH4OH 缓冲溶液中，Co2+与半胱氨酸能形成稳定的高灵敏度络合物，在紫外区有特征吸收，于284nm、358 nm 处测其吸光度。实验条件下的半胱氨酸与Co2+ 的结合比及稳定性与反应时浓度有关，Co2+过量于半胱氨酸或半胱氨酸过量于Co2+ 生成不同结合比的络合物，其稳定常数也不同，所测得的吸光度也不同。以此建立了测定半胱氨酸分光光度分析方法。方法简便、快速，具有较高灵敏度和较好的选择性。1.1.2.3邻二氮菲- 铁( )分光光度法测定半胱氨酸的含量11邻二氮菲Fe3 +氧化体系的应用，研究了邻二氮菲铁( )与半胱氨酸的反应，发现其产物为稳定红色螯合物，可用间接光度法定量测定反应物中的半胱氨酸。其产物吸光度值符合朗伯比耳定律。采用本法测定谷氨酸、赖氨酸、半胱氨酸混合试样中半胱氨酸含量，相对标准偏差2% ，结果令人满意。1.1.2.4亚硝酰铁氰化钠分光广度法测定半胱氨酸的含量12亚硝酰铁氰化钠与半胱氨酸的巯基在氨性条件下反应， 产生特征的酒红色， 其颜色与吸光度的关系符合朗伯比尔定律.该法灵敏度高，选择性好，干扰少，适用于复杂样品中半胱氨酸含量的测定。 1.1.3 旋光度测量法测定半胱氨酸的含量当平面偏振光通过含有某些光学活性物质的液体或溶液时，能引起旋光现象，使偏振光的振动平面向左或向右旋转，偏振光旋转的度数称为旋光度。旋光度测定法就是利用平面偏振光通过含有某些光学活性物质的液体或溶液时发生的旋光现象来测量药物或检查药物的纯杂程度的方法，也可用来测定含量。 由于L 2半胱氨酸有不对称碳原子，当偏振光通过时发生偏振面的旋转，因此具有旋光性。而偏振面的旋转角度与溶液的浓度成正比，所以我们利用这一性质配制一系列标准浓度L 2半胱氨酸的溶液来测其旋光度， 这样就可以得出一条旋光度对浓度的标准工作曲线，只要测其样品的旋光度就可以从标准曲线上找出其相应的含量13。L-半胱氨酸含量测量方法中，旋光度法和吸光度法最简便准确，在无其他旋光性物质的体系中，可以选用旋光度法；若体系中有其他旋光性物质，可以选用吸光度法测量L-半胱氨酸的含量。1.1.4 荧光光谱法测定半胱氨酸 荧光光谱分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的仪器方法。 廖文生14等利用钛铁试剂- 铜配合物荧光光谱法测定半胱氨酸。在pH 8. 0的B - R缓冲溶液中L -半胱氨酸与钛铁试剂- 铜配合物的作用，当半胱氨酸的加入导致钛铁试剂-铜配合物在350 nm处的荧光显著增强，并且在一定浓度范围内体系荧光强度的增大与半胱氨酸浓度呈良好的线性相关性，据此建立了一种测定半胱氨酸的新方法。1.1.5流动注射荧光法测定药物中半胱氨酸的含量流动注射荧光光谱法15是荧光光谱法和流动注射技术联用的一种新的分析方法。在近中性介质及聚乙烯醇(PVA) 存在下，半胱氨酸能熄灭一个新的荧光试剂5 - (4 -氯苯基) - 8 -苯磺酰氨基喹啉(CPBSQ) 与Cu( II) 络合体系的荧光的反应。其原理为：CPBSQ 与Cu( II) 络合体系产生荧光络合物，而半胱氨酸可将Cu( II)还原成Cu ( I)，从而使体系的荧光熄灭。基于此现象建立了一个简单、快速、灵敏和选择性的测定半胱氨酸的流动注射荧光方法.。1.1.6 原子吸收光谱法间接测定半胱氨酸的含量原子吸收光谱法是利用气态原子可以吸收一定波长的光辐射，使原子中外层的电子从基态跃迁到激发态的现象而建立的。由于各种原子中电子的能级不同，将有选择性地共振吸收一定波长的辐射光，这个共振吸收波长恰好等于该原子受激发后发射光谱的波长，由此可作为元素定性的依据，而吸收辐射的强度可作为定量的依据。刘文涵16等利用新生成的ZnS悬浮液与半胱氨酸在碱性条件下，反应生成可溶性半胱氨酸锌络合物，离心分离后用塞曼原子吸收光谱测定溶液中的锌质量浓度即可间接的得到半胱氨酸的含量，研究选择了原子吸收间接测定半胱氨酸的最佳条件和方法，在pH 9.70 的2% 硼砂底液中于室温下使半胱氨酸试液与新生成的ZnS 悬浮液反应。1.2 本文研究目标 荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子之间发生猝灭，荧光猝灭分为静态淬灭和动态猝灭。利用某种物质对某一种荧光物质的荧光猝灭作用而建立的对该淬灭剂的荧光测定方法，即为荧光淬灭法。随着科学技术的不断创新，荧光淬灭法越来越重要，必将应用于更多科学领域。本文通过钙黄绿素是一种具有荧光性的物质，Cu( ) 与钙黄绿素配位引起荧光猝灭。继而探索半胱氨酸的加入对体系的影响，并进行优化实验来探究最佳实验条件。2 实验部分2.1 仪器、药品、试剂F-4500荧光分光光度仪（日立）电子天平（AL204，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）数显pH计（雷磁PHS25）半胱氨酸标准品（浙江方强制药厂有限责任公司）半胱氨酸待测品 (浙江京新药业股份有限公司)其他分析试剂（CuSO4，钙黄绿素，磷酸二氢钾，氢氧化钠）均产自国产2.2 实验步骤2.2.1 储备溶液配制钙黄绿素储备溶液(1.010-3mol /L) :称取0.3287g钙黄绿素固体，加0.1 mol/L的NaOH 溶液25mL溶解后，转入500 mL的容量瓶，水定容，4保存，使用时再用水稀释至所需浓度。硫酸铜储备溶液（1.010-5mol /L）：称取0.0288g于烧杯中加水溶解，转移至100ml容量瓶，定容配成1.010-3 mol /L硫酸铜溶液，取1毫升1.010-3 mol/L硫酸铜至100容量瓶定容，稀释成1.010-5 mol/L硫酸铜溶液。半胱氨酸储备溶液（1.010-3 mol/L）：称取半胱氨酸标准样品0.012g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，配成0.001mol/L的水溶液。再移取一毫升的半胱氨酸，用蒸馏水溶解并定容至100ml，配成1.010-5 mol /L的标准溶液。磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液的配制：移取氢氧化钠5毫升，在移取一系列的磷酸二氢钾从而配的不同pH的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液。2.2.2 体系的激发和发射光谱固定激发波长，扫描钙黄绿素溶液得到其发射光谱；固定发射波长，扫描钙黄绿素溶液，得到其激发光谱，从而确定其最大发射光谱和最大激发波长。2.2.3.钙黄绿素及铜离子浓度比对荧光强度的影响分别测定nCu2+:n钙黄绿素=1:1，1:2，2:1时的荧光值，以荧光强度对nCu2+:n钙黄绿素作图。2.2.4 标准曲线的绘制及线性关系考察精密称取半胱氨酸标准样品0.012g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，配成0.001mol/L的水溶液。再移取一毫升的半胱氨酸，用蒸馏水溶解并定容至100ml，配成1.010-5 mol /L的标准溶液。于一系列25ml容量瓶中，分别依次加入0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml 1. 0 10-5 mol /L半胱氨酸标准溶液，5.0ml 1.010-5 mol /L钙黄绿素分析液，5.0ml 1.010-5 mol /L CuSO4标准溶液后，用pH8.0的KH2PO4-NaOH缓冲液定容至刻度，放置20min后，以493nm为激发波长，510nm为发射波长，测定溶液的相对荧光强度，绘制标准曲线，得线性回归方程及相关系数。2.2.5缓冲溶液pH对荧光强度的影响 配置不同pH值的KH2PO4-NaOH缓冲液，分别加入铜离子与钙黄绿素的浓度均为1.010-5mol/L各5ml，再用缓冲溶液定容至刻度。待体系稳定后测定其荧光值。2.2.6反应时间对荧光强度的影响 在pH8.0的KH2PO4-NaOH缓冲液中，分别加入铜离子与钙黄绿素的浓度均为1.010-5 mol /L各5ml，用缓冲溶液定容至刻度。在一定的激发波长和发射波长下，在30min前每隔5min测定钙黄绿素-铜体系的荧光强度，30min后每隔15min测定一次，一直到体系稳定为止。2.2.7 精密度实验 于25mL比色管中，分别加入2ml，4ml，6ml 1. 0 10-5 mol /L半胱氨酸标准溶液，5.0ml 1.010-5mol /L钙黄绿素分析液，5.0ml 1.010-5 mol /L CuSO4标准溶液后，用pH8.0的KH2PO4-NaOH缓冲液定容至刻度，放置20min后，以493nm为激发波长，510nm为发射波长，测定溶液的相对荧光强度平行测定3次，求得RSD。2.2.8 回收率实验为了验证方法的准确性，精密称取已知含量的半胱氨酸适量，加入一定量的半胱氨酸对照品，按实验方法制成样品样，测定其含量，计算回收率。2.2.9 样品半胱氨酸含量的测定 称取一定量的半胱氨酸样品，用蒸馏水定容至250mL。再按上述方法制备样品液，测定半胱氨酸的相对荧光强度，再用回归方程求取半胱氨酸的含量。3 实验结果与讨论3.1 磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液的配制表3-1磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲溶液的配制PH(20)X(毫升)Y（毫升）6.0150.5706.8052.9637.2954.2808.0054.4808.2054.700 3.2 荧光化合物的发射和激发光谱按2.2.2项下方法，在200700nm波长范围内分别对钙黄绿素液，钙黄绿素-铜混合溶液进行发射波长和激发波长的扫描。所得发射及激发光谱见。图3-1 钙黄绿素激发光谱 图3-2 钙黄绿素铜混合液的激发光谱 图3-3 钙黄绿素的发射光谱图3-4 钙黄绿素及钙黄绿素-铜配合物的发射光谱由图可见，激发波长493nm，发射波长510nm的条件下，钙黄绿素与铜配合能发生较好的荧光猝灭。所以本实验选择493nm为激发波长，510nm为发射波长。3.3 钙黄绿素及铜离子浓度比n的选择图3-5钙黄绿素及铜离子浓度比n对荧光值的影响 3.4 半胱氨酸标准曲线 F0=1246图3-6 半胱氨酸的标准曲线所得数据经回归处理，测定的标准曲线为：Y=22.475x 64.1 其中Y为相对荧光强度，X为半胱氨酸的浓度（10umol/L）。相关系数r=0.9926。 结果表明：在4 - 20(10umol/L)范围内，半胱氨酸浓度与荧光强度呈良好线性关系。 3.5 缓冲溶液pH对荧光强度的影响 结果如下表所示。图3-7缓冲溶液pH的影响 由图可知，在酸性条件下相对荧光强度较强，随着pH的增大，荧光值逐渐 下降，再增大时pH又随之增大。 3.6 反应时间对荧光强度的影响图3-8反应时间对荧光强度的影响由图可知，随着反应时间的增加，相对荧光强度逐渐减弱。但在反应25分钟后，相对荧光强度变化较平缓，基本反应完全。所以，选取最佳反应时间为30分钟。3.7 精密度实验 从半胱氨酸标准液中精密吸取2mL，4mL，6mL到25mL比色管中，按标准曲线下操作，测定样品中半胱氨酸的荧光强度（平行测定3次）。结果见表表3-2 精密度实验实验号荧光强度测定值（umol/L）百分含量（%）平均值（%）RSD（%）113550.7796.1297.220.907213590.7998.42313570.7897.11415391.5999.18100.100.362515421.60100.11615421.6099.99717012.3196.2296.210.250816992.3096.18917012.3196.23 从由上表可知，半胱氨酸的平均百分含量为97.22%，100.10%，96.21%，RSD分别为0.907%，0.362%，0.250%，说明本实验方法精密度好。3.8 回收率的测定 精密称取已知含量的半胱氨酸标准品适量，配成溶液。加入一定量的半胱氨酸对照品于25mL比色管中，按上述方法配成溶液后，再按上述实验步骤测得其荧光值，同上述含量测定方法测定半胱氨酸标准品含量，计算回收率。其结果见表表3-3 回收率实验实验号 标准样(umol) 加入量(umol) 测定值(umol) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%)1 0.0295 0.0112 0.0410 103.02 0.0295 0.0112 0.0409 102.0 101.9 1.033 0.0295 0.0112 0.0408 100.9 实验结果表明：半胱氨酸的平均回收率为101.9%，RSD为1.03%。 3.9样品溶液的测定从样品液中精密吸取0.1mL到10mL比色管中，按实验方法测定样品中半胱氨酸的荧光强度，用回归方程求取含量。其结果见表。表3-4 片剂中半胱氨酸含量试验号 荧光强度 测定值（mg/10mg） 百分含量% 平均值（%） RSD（%） 1 2061 4.77 47.73 2 2023 4.75 47.48 47.67 0.343 2069 4.78 47.79结果分析：10mg片剂中的平均含量为4.77mg，平均百分含量为47.67%，其RSD为0.34%。4 结论 在激发波长493nm，发射波长510nm的条件下，钙黄绿素与铜能发生较好的荧光猝灭。所以本实验选择493nm为激发波长，510nm为发射波长。 查文献得知，Cu2+与钙黄绿素比例的不同，则体系的背景信号也会不同。在pH8.0的KH2PO4-NaOH缓冲液中，Cu2+与钙黄绿素的浓度为1. 010-5 mol /L时，Cu2+与钙黄绿素的比例不同，测得体系的荧光值也会不同，当Cu2+与钙黄绿素的物质的量之比小于1:1时，当铜离子的量加大后，溶液的荧光会迅速下降，但此体系背景信号程度过低，因为对于此体系，钙黄绿素相对来说是过量，铜离子含量相对不足，即原体系荧光度一直很强，对于之后的半胱氨酸的加入，则对原体系影响不大。当铜离子与钙黄绿素的物质的量之比大于1:1时，溶液的荧光猝灭程度趋于平缓，对于此体系，铜相对来说是过量的。由于铜离子与半胱氨酸的结合度比铜离子与钙黄绿素的结合度要牢固，故若溶液中存在过量的铜离子，部分半胱氨酸将首先与过量的铜离子反应，而不是去夺取钙黄绿素-铜离子配合物中的铜离子，因此测定的灵敏度将降低。故本实验选取的体系为铜离子与钙黄绿素之比为1:1。 在实验标准条件下，以半胱氨酸标准品与荧光强度绘制标准曲线，得出线性回归方程：y=22.475x-64.1，相关系数r为0.9926。改变反应的条件pH，来探究对荧光值的影响，得出在酸性条件下相对荧光强度较强，随着pH的增大，荧光值逐渐下降，再增大时pH又随之增大。分析这是由于当pH值偏小时，铜离子与钙黄绿素的结合程度不牢固，即溶液中游离的钙黄绿素较多，所以此时的荧光值较大，随着pH值的升高，钙黄绿素与铜的结合程度越来越牢固，故荧光值逐渐下降，但当pH偏过高时，OH-1会和Cu2+结合，使溶液中游离的钙黄绿素又增大，则荧光值又升高，由表可知，pH为8.00处时为最佳pH值。探究反应时间对荧光值的影响，得出随着反应时间的增加，相对荧光强度逐渐减弱，但在反应25分钟后，相对荧光强度变化较平缓，基本反应完全，所以，选取最佳反应时间为30分钟。 最后利用荧光猝灭法对片剂中半胱氨酸的含量进行测定。设置激发波长为493nm，发射波长为510nm，测得片剂中半胱氨酸的含量为47.67%，RSD为0.34% ，平均回收率为101.9%，RSD为0.34%。参考文献 1李爱玲，高兰兴. 氨基酸对心血管功能的影响，J .氨基酸和生物资源，1998 ， 20 (2) :4546.2Hsiao Y，Su W，Cheng J，et al. 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