基因工程操作的工具酶zxppt课件

2019/3/28,1,基因工程原理和技术,A. 用于核酸操作的工具酶 B .用于基因克隆的载体 C. 用于基因转移的受体菌或细胞,用于核酸操作的工具酶有哪些？,体外重组DNA技术所需的基本条件？,第2章 基因工程操作的工具酶,基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DN聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。,基因工程工具酶,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。,何谓限制性核酸内切酶？是如何发现的.,限制性核酸内切酶 (restriction endonuelease) 这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。 是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。,限制性内切酶的发现 限制性内切酶的分类 限制性内切酶的命名以及识别特点 型限制性内切酶的切割方式 型限制性内切酶的反应条件 影响限制性内切酶活性的因素,2.1 限制性核酸内切酶 (restriction enzyme),寄主控制的限制（restriction） 与修饰 (modification) 现象： 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。,噬菌体侵染细菌,细菌的限制修饰作用,1952 年，Luria 和 Human， 1953年，Bertani 和 Weigle 发现细菌的限制（restriction）现象：,E.coli k,E .coli B【E .coli B 限制 （k）】,感染,不感染,限制与修饰现象,phage(K),噬菌体侵染细菌,仍有少量phage (K) 可在 E. coli B 中生存，是因为E.coli B phage 对 (K) 进行了修饰。,大肠杆菌B,大肠杆菌K,修饰的phage (B),修饰的phage (K),10-4（限制作用）,10-4（限制作用）,1（修饰作用）,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。,寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶,R-M 系统,R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。细菌 R-M 系统的限制酶可以降解外源 DNA，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身 DNA，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。,R-M 系统,限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。,1968 Linn 和 Arber 从 E.coli B 中发现限制酶 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans 因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 。,2.1.1 限制性核酸内切酶的发现,限制性核酸内切酶（限制酶）： 在细胞内能够识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。,根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类： 型酶、型酶、 型酶,2.1.2 限制性核酸内切酶的分类,型限制酶（无用） 1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。 分子量：30万dal左右 组成：3种亚基 特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。 修饰亚基：具甲基化酶活性。 限制亚基：具核酸内切酶活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM。 识别和切割位点：不一致（距识别位点5一侧数千碱基处随机切割DNA分子）。,型限制酶（十分有用） 1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量：2万10万dal（较小） 组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。 辅助因子：无需辅助因子，或只需Mg2+。 识别和切割位点：相一致。,型限制酶（无用） 组成：两个亚基 M亚基：负责位点的识别与修饰。 R亚基：具核酸酶的活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM 识别和切割位点：不一致（距识别位点一侧约25bp处切割DNA分子）。,限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的类型 主要特性 I 型 II 型 III 型 限制修饰 多功能 单功能 双功能 蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM 识别序列 TGAN8TGCT 旋转对称序列 GAGCC GAGCC AACN6GTGC AAN6GTGC CAGCAG ： 切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内 距识别序列 或附近 下游 随机性切割 特异性切割 24-26bp处,2.1.3 限制性核酸内切酶的命名以及识别特点,限制性核酸内切酶的命名原则： 第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。,EcoR I,Escherichia,属名,Coli,种名,Ry13,株系,编号,若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。,限制酶的命名,绝大多数的型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。 限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。,在 DNA 分子双链的特异性识别序列部位，切割 DNA 分子，产生链的断裂。 2 个单链断裂部位在 DNA 分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的 DNA 片段，具有互补的单链延伸末端。,限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基,4 个碱基识别位点：Sau3A GATC,5 个碱基识别位点：EcoR CCWGG Nci CCSGG,(1)限制酶识别序列的长度,6 个碱基识别位点： EcoR GAATTC Hind AAGCTT 7 个碱基识别位点： BbvC CCTCAGC PpuM RGGWCCY 8 个碱基识别位点： Not GCGGCCGC Sfi GGCCNNNNNGGCC,当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。,由于那些长的识别序列和富GC或富AT的识别序列在DNA分子中出现的概率很低，所以把这些识别序列相应的限制性核酸内切酶称为稀切酶(rare cutting enzymes)。为了获得大的片段，有时须采用稀切酶切割,识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。,(2) 限制酶识别序列的结构,识别序列有连续的（如GATC）和间断的 (如 GANTC)两种，它们都呈回文结构。,类限制酶识别序列特点 回文结构(palindrome),正读与反读都相同。 以识别序列的中线为对称轴，左右两侧的碱基互补。 为便于书写，识别序列可以以5 3走向的单链DNA表示。,DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点，用或表示。,(3)限制酶切割的位置,切割的位点：一般在识别序列内部，如GGATCC、ATCGAT、GTCGAC、CCGCGG、AGCGCT等。 少数在识别序列的两侧，如GATC、CATG、CCAGG等,EcoR ,5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5,不同核酸内切酶的特异识别位点,A A G C T T,T T C G A A,A,B,C,D,DNA,DNA,Hind,Hind切割位点,核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用,限制性核酸内切酶以环状和线形的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3OH基团和5P基团的片段,2.1.4 限制性核酸内切酶的切割方式,1、限制酶产生匹配粘端,若在对称轴 5侧切割底物， DNA 双链交错断开产生 5突出粘性末端。,(a)5P单链延伸的粘性末端,若在 3-侧切割，则产生 3 突出粘性末端,(b)3OH单链延伸的粘性末端,在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如 Hae（GGCC）和 EcoRV（GATATC）。,2、限制酶产生平末端,粘性末端、平整末端 200多种限制性内切酶，切点各不相同。,许多限制酶切割DNA产生非对称突出末端。 当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如 Bbc,它的识别切割位点如下： CCTCAGC GGAGT CG,3、限制酶产生非对称突出末端,平齐末端（如 Sma、Alu、Hae）,5粘性末端（如 EcoR ）,5-G- -AATTC-3,3-CTTAA- -G-5,3粘性末端（如 Pst ）,三种酶切末端,同裂酶（isoschizomer）,有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶特称为同裂酶。同裂酶的切点位置可相同或不同。,（a）切点位置相同,（b）切点位置不相同,有些限制性内切酶虽然来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。 利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。,同尾酶（isocaudamer）,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,Bcl,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl,BamH Bcl Bgl三种酶可产生相同的 5GATC 粘性末端，由这种同尾酶产生的 DNA 片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。,杂种位点（hybrid site） 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 BamH G GATC C Bcl T GATC A C CTAG G A CTAG T 杂种位点 ： GATC C （ BamH ） CTAG T（ Bcl ）,某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变。,限制酶的第二活性： 在甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子、酶与DNA的比例等参数单独或同时发生改变时，会导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称为限制酶的第二活性，又称星活性。能产生第二活性的酶常在酶名称的右上角加一星号“”，如EcoR 。,限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须 有一定数量的核苷酸，否则限制酶难以发挥切割活性。,对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。,位点偏爱（Site preference）,反应系统包括：酶、底物、反应缓冲液、合适的反应温度等。,2.1.5 限制性核酸内切酶的反应条件,1酶活性单位（U）： 某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，60 min内完全切割 1g DNA所需的酶活性。,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：,Tris-HCl 50 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM NaCl 0 - 150 mM DTT 1 mM Volume 20 - 100 ml T T 37 1 - 1.5 hr,0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶,1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 g 标准DNA所需的酶量,1、缓冲液 常规缓冲液一般包括提供稳定PH的缓冲剂、 Mg2+、牛血清蛋白 (BSA)、二硫苏糖醇(DTT)。,2、反应温度 大多数酶的标准反应温度 37度。 3、反应时间 通常是小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶量。 4、终止酶切的方法 EDTA可螯合Mg2+，从而可终止酶切反应；加热。,限制性内切酶识别特异性放宽 EcoR在正常情况下识别 GAATTC 序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过 5%，其识别位点发生松动，可在 AATT 处发生切割，EcoR这种特殊的识别能力叫做星活性，用 EcoR*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。,星星活性 （ Star activity ）,影响因素： 甘油浓度 12-20%，酶与 DNA 比例，离子强度，45% 聚乙二醇 (PEG)，有机溶剂，8% 二甲基亚枫，二价阳离子，12% 乙醇。,抑制星星活性的措施： 如减少酶的用量（可避免过份酶切），减少甘油浓度，保证反应体系中无有机溶剂或乙醇，提高离子强度到 100150mM （如果不会抑制酶的活性的话），降低反应 pH 至 pH7.0 ，以及保证使用 Mg2+作为二价阳离子。,限制性核酸内切酶反应影响因素： 温度、缓冲液、时间、反应体积和甘油浓度、DNA纯度和结构等。,2.1.6 影响 限制性核酸内切酶活性的因素,1、DNA样品的纯度,蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,加大酶的用量，1 mg DNA 用 10 U 酶,加大反应总体积,延长反应时间,DNA 浓度 DNA 过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 如：4g DNA /1U HPa 50l 37 15h 1g DNA /1U HPa 50l 37 1h,2、DNA样品的甲基化程度,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、Mbo I等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响。,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等。,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基。,3、DNA 的分子结构 如：超螺旋 DNA (病毒或质粒) 比线状 DNA 需酶多 识别位点及邻近位点特异性序列 如：pBR322 DNA 有 4个 Nar切点 (GGCGCC)其中 2 个切点用1U 酶水解 1h 完全切开, 2 个切点用50U 酶水解 16h 水解不完全。 Xma 切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割。,4、酶切反应的温度 大多数的最适反应温度是37，而少数酶的最适反应温度高于或低于37。,5、限制性核酸内切酶的缓冲液 氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇(DTT)或-巯基乙醇(2-Me)、Tris-HCI或Tris-Ac。,（1）缓冲液（无菌、无污染） （2）金属离子 如：型酶需 Mg2+，若以 Mn2+ 代替Mg2+ （如Hind，EcoRI）则特异性改变。 离子浓度不合适会抑制酶活。,（3）牛血清蛋白 (BSA) BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。,二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇： 维持酶活性的稳定。 Tris-HCl或Tris-Ac： 维持酶活性适合的PH环境。,限制性核酸内切酶的Star活性 几乎所有的限制酶都具有Star活性。 Star活性的影响：导致切割中出现非特异性DNA片段，甚至不能获得预计的DNA片段，影响进一步的DNA连接重组。 排除方法：如降低反应系统中甘油含量，控制pH中性和高盐浓度下进行反应。,重组DNA前的切割 构建新质粒 构建物理图谱 DNA分子杂交 用限制性内切酶消化受体DNA 制备DNA探针 亚克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究,限制性核酸内切酶的应用,DNA连接酶的连接机制 DNA连接酶的种类 DNA连接酶的反应体系 影响连接反应的因素,2.2 DNA连接酶(DNA ligase),DNA连接酶的发现 1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(1igase)。,DNA连接酶是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP(动物与噬菌体)或NAD (细菌) 水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。 但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。,DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。反应过程可分三步：,2.2.1 DNA连接酶的连接机制,(1)NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸。 将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸; (3)这个被激活的5-磷酰基端可以和DNA的3-OH端反应合成磷酸二酯键，同时释放出AMP。,DNA连接酶所催化的整个过程是可逆的。 酶-腺苷酸中间物可以与NMN或PPi反应生成NDA或ATP及游离酶;DNA-腺苷酸也可以和NMN及游离酶作用重新生成NAD。该逆反应过程可以在AMP存在的情况下使共价闭环超螺旋DNA被连接酶催化，产生有缺口的DNA-腺苷酸，生成松弛的闭环DNA。,DNA连接酶的基本性质,(1) 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,(2) 修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,(3) 连接多个平头双链DNA分子,2.2.2 DNA连接酶的种类,T4DNA 连接酶 大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的； T4 DNA连接酶 ATP 大肠杆菌 DNA 连接酶 大肠杆菌染色体编码的； DNA连接酶 NAD+,T4DNA 连接酶 噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为68KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。是基因工程中常用的连接酶是T4连接酶。,可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可使平端的双链 DNA 分子相互连接。还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA 杂交双链中的单链切口。 反应底物为黏端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA。 反应系统中必须加有辅助因子ATP,AATTC G,G CTTAA,AATTC G,G CTTAA,5,5,5,5,(1),AATTC G,G CTTAA,AATTC G,G CTTAA,5,5,(a)分子间连接,(b)分子内连接,T4连接酶,(2),(1),(2),噬菌体T4DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。,大肠杆菌 DNA 连接酶 大肠杆菌DNA连接酶的相对分子量为75KD，对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。,DNA连接酶的主要功能： 就是在DNA聚合酶催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。 基因工程中不常用,大肠杆菌DNA连接酶，只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子。 反应系统中必须含NAD+作为辅助因子。 另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。 无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。,2.2.3 DNA连接酶的反应体系,T4DNA 连接酶的活性单位(Weiss)： 一个韦氏单位是指在37 ，20min 内催化1nmol32P从焦磷酸根置换到，-32P- ATP所需的酶量。 连接反应根据DNA片段的分子大小及末端结构，在1230 下反应116小时。,2.2.4 影响连接反应的因素,1. 反应温度： 连接缺口的温度：37 连接粘性末端的最佳温度： 1216 平头末端的最佳温度： 1020 ，温度过高会导致T4DNA 连接酶的不稳定。,2. T4DNA连接酶的用量： 平末端DNA分子的连接反应中，最适12个单位。 粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。 ATP的用量10mol1mmol/L之间 3. 提高外源片断与载体的浓度的比值，（1020倍）,大肠杆菌DNA 聚合酶 Klenow DNA 聚合酶 T噬菌体DNA 聚合酶 T7噬菌体DNA 聚合酶 耐热DNA 聚合酶,2.3 DNA 聚合酶（DNA polymerase）,DNA 聚合酶 是细胞复制DNA的重要作用酶。以DNA为复制模板，从将DNA由5端点开始复制到3端的酶。 指在 DNA (或 RNA) 模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物 3 OH 末端聚合DNA 链的一类酶。 DNA 聚合酶在 DNA复制时起关键作用。,常用的DNA聚合酶： 大肠杆菌DNA聚合酶； 大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段酶； T4DNA聚合酶； T7DNA聚合酶； 反转录酶等。,DNA 聚合酶主要有三类： 聚合酶（pol），聚合酶(pol) ，聚合酶(pol)。 其中聚合酶参与 DNA 修复，聚合酶参与 DNA 复制。聚合酶是基因工程中的常用酶。,2.3.1 大肠杆菌DNA 聚合酶,DNA 聚合酶和 的比较,DNA 聚合酶的特点： 需模板 (DNA 或 RNA)； 需引物； 具有三种酶活性，即 5 3聚合酶活性；5 3外切酶活性和 3 5外切外切酶活性。,来源 E.coli，由染色体 DNA 基因编码。商品上用的此酶来源于 Phage NM964 整合的溶源性 E.coli。 结构 单链多肽链，MW = 109，000 D。,大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：,53的DNA聚合酶活性 53的核酸外切酶活性 35的核酸外切酶活性 交换（置换）反应,大肠杆菌DNA聚合酶 I的活性,53聚合酶活性,53外切酶活性,35外切酶活性,交换反应,如果只有一种dNTP存在， 5 3外切核酸酶活性将从3OH端降解DNA，然后在该位置发生一系列连续的合成和外切反应，直到露出与该dNTP互补的碱基。,大肠杆菌DNA聚合酶 I的用途,切口平移（ Nick translation ）法标记DNA 制备32P标记的探针,DNA 聚合酶在分子克隆中的主要用途是通过 DNA 缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的 DNA 探针。此时， DNA 聚合酶的 5- 3核酸外切酶活性和 5-3 聚合酶活性同时发生。,5-3外切酶活性,5-3聚合酶活性,未经标记的核苷酸,经标记的核苷酸,32P标记的DNA 杂交探针的制备,探针（probe）,探针：用来探知被测物存在的小 DNA 或RNA叫做探针。 标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。 分子杂交：探针 DNA 或 RNA 与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecular hybridization）。,来源 E.coli DNA Polymerase经蛋白酶水解的大片段 (Klenow 和 Henningseon.1970）,Klenow 5 3聚合 3 5外切,5 3外切,2.3.2 Klenow DNA 聚合酶,无5 3外切酶活性,Klenow酶的基本用途： 补平由核酸内切酶产生的5粘性末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,DNA片段的同位素末端标记,Klenow 在无底物时只进行 3 5外切；有底物存在时则聚合。 这种标记也称作交换标记，但 Klenow 作用不如T4DNA聚合酶。,来源：T4Phage 感染的 E.coli 结构：MW=114,000 d 活性： 53聚合活性； 35外切活性，对单链活性大于双链DNA，外切酶活性比 Klenow 大 200 倍 用途 填补或标记限制酶切后产生的 5- 粘性末端的3-凹缺末端。（同 Klenow） 3- 粘性末端的标记制备 DNA探针,同 Klenow 末端标记。 ,2.3.3 T4DNA 聚合酶,来源：T7 Phage 感染的 E.coli 结构：由 2 个蛋白亚基组成： T7 phage gene 5 蛋白 + 宿主硫氧蛋白 活性： 53聚合，持续反应时间最长，所以合成的 DNA 链长。故在 DNA 测序中很优越。 35外切，是 DNA 聚合酶的 1000倍。,2.3.4 T7DNA聚合酶与测序酶,用途 复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列 用填补或交换反应快速进行末端标记。 与 TDNApol一样，平齐粘性末端。 定点突变中互补链的合成。,修饰的 T7DNA 聚合酶(测序酶),来源： 天然 TDNA 聚合酶经修饰处理 结构： 同T聚合酶。 用还原剂、分子氧、低浓度 Fe+与酶保温几天，可使Phage T7 gene5 蛋白 N- 端35外切酶活性中心失活 (O- 修饰)。 即：53聚合酶作用提高，持续性长。3 5外切作用下降 99% 以上。,2.3.5 Taq DNA 聚合酶,来源： 从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。 结构： 单亚基 MW = 94,000 d。 活性： 聚合最适温度为 75-80，不具35外切酶活性，具53外切活性 。,用途： PCR 反应。 测序，高温下进行 DNA 合成可减少模板二级结构。,2.3.6 反转录酶 依赖于RNA的DNA聚合酶,来源：商品反转录酶有两种 来自禽类成髓细胞瘤病毒 (AMV)。 来自能表达 Moloney 鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的 E.coli。,结构和活性：,活性：,53的DNA聚合酶活性（需要Mg2+ ） 53RNA核酸外切酶活性（RNAseH） 35RNA核酸外切酶活性（RNAseH）,产生含5磷酸及3羟基的长420个碱基的核苷酸。,反转录酶的基本特性： 以RNA为模板聚合cDNA链。,反转录酶的基本特性： 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链。,反转录酶,反转录酶,5 DNA,3,对 RNA:DNA 杂交体中的 RNA 特异性地降解，免除了在反转录完成后再用 NaOH 降解 RNA 模板的步骤。,反转录酶用途：,来自小牛胸腺，只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的 DNA 聚合酶 (Chang 和Bollum,1986)。,来源：,MW = 60,000 d.,结构：,2.4末端转移酶(terminal transferase) (不依赖模板的 DNA 聚合酶),催化 dNTP 掺入 DNA 3-OH 末端，形成同聚物末端；反应不需模板 DNA，需 Co2+或Mg2+ 。 若dNTP 为T或C，此时首选Co2+； 若dNTP 为A或G，此时首选Mg2+ 。,活性：,用途： 克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。 末端标记,来TdT的基本特性：,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs。,5 p,3 HO,AAAAAAAAAA OH 3,p 5,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+ dATP,5 p,3 HO AAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAA OH 3,p 5,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+ dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAAOH 3,p 5,AAAAAAAAA,2.5 S1核酸酶,S1 核酸酶的基本特性 是一种高度单链特异的核酸内切酶，可降解单链DNA或RNA核酸。 来自米曲霉菌（Aspergillus oryzae） 用于把具粘性末端的 DNA 变为平齐末端 的 DNA。 在 DNA 部分变性条件下，能在富含 AT 区切断 DNA。,S1 核酸酶的基本特性 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍 Zn2+必需 最适pH范围为4.0 - 4.3 需要NaCl 10 - 300 mM 降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍,S1 核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA,S1 核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA,S1 核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1 mapping）,杂交,S1,2.6 核酸外切酶,核酸外切酶(exonuclease):是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶 按照酶对底物的二级结构的专一性，分三类： 作用于单链的核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII） 作用于双链的核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII） 既可作用于单链又可作用于双链的核酸外切酶,1、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）,大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+,ExoVII,3,5,3,5,3,5,3,5,它主要应用于测定基因组DNA中内含子和外显子的位置,2、双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）,大肠杆菌核酸外切酶 III 特异性地从3 端外切,ExoIII,3,5,3,5,3,5,3,5,它主要用途是通过部份降解双链DNA片段，产生部分单链DNA区域，作为DNA聚合酶的模板,Mg2+,Bal31 核酸酶 既可作用于单链又可作用于双链的核酸外切酶 来自埃斯波加纳互生单胞菌（A.espejiana） 从 DNA 末端同时降解两条链。 用于基因表达调控序列的研究。,3、单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶,主要表现为3 外切酶活性同时伴有5外切及较弱的内切酶活性,2.7 T4噬菌体多核苷酸激酶（T4-PNP）,T4多核苷酸激酶的基本特性： 在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷,5 HO,3 HO,OH 3,OH 5,T4多核苷酸激酶（标记） 在分子克隆中呈两种反应： 其一是正反应，指将ATP的磷酸基团转移至无磷酸 的DNA5末端，用于对缺乏5磷酸的DNA进行磷酸化。 其二是交换反应，在过量ATP存在的情况下，该酶可将DNA的5端磷酸转移给ADP，然后DNA从ATP中获得磷酸而重新磷酸化。,2.8 碱性磷酸酶,碱性磷酸酶（防止自身环化） 来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP），特异性强 来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP），耐 热,CIP应用更广，用于末端标记，防止自我环化。,该酶用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸根，使5-P成为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。,5HO A T T A G C C C G T A A T C G G G C OH 5,多核苷酸激酶,磷酸甲酯酶 Phosphomonoesterase,5p A T T A G C C C G T A A T C G G G C p 5,（一）思考与探究,1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段： (1) CTGCA (2) AC (3) GC G TG CG（4） G (5) G (6) GC CTTAA ACGTC CG (7) GT (8)AATTC CA G 你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？,答： 2和7能连接形成ACGT TGCA； 4和8能连接形成GAATTC CTTAAG； 3和6能连接形成GCGC CGCG； 1和5能连接形成CTGCAG GACGTC。,2.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？,提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套