分子克隆技术讲解课件

植保生物技术讲座05,第五讲 分子克隆技术,克隆载体,是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的序列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细胞)。 其共性有四点： 1. 启动自发复制的能力. 2. 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择。 3. 唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA 4. 非必需DNA序列 尽可能少以克隆更大片段。,pBR322,pBR322,pBR322是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆之用。,四个重要位点,(1) 负责质粒复制的rep复制子 (来自 pMB1; (2) 编码Rop 蛋白的rop基因，促进不稳定的 RNA I RNA II 复合体转变为稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的作用 (来自 pMB1); (3) 编码 beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 Tn3转座子); (4) 编码四环素抗性蛋白的tet基因 (来自 pSC101).,pUC系列质粒,是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多克隆位点处于表达LacZ基因产物-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表达的肽补充了大肠杆菌却失的肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了肽的表达，因而在加入IPTG和Xgal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。,pUC19,pUC18 和 pUC19,小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变，因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域含有CAP （代谢物活化蛋白）结合位点, 启动子Plac, lac 阻遏蛋白结合位点 编码beta-半乳糖苷酶N-端的多肽的lacZ基因的5端(来自 M13mp18/19).。这个多肽片段的合成可受IPTG诱导， 与突变菌(mutation lacZDM15)实现 alfa互补。,pUC18和 pUC19,pUC19图,pBluescript II系列,均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方向不同。,pBluescript II载体上的重要位点,(1) f1 (IG) 噬菌体 f1的基因间区; (2) rep (pMB1) pMB1 的复制子，负责质粒的复制； (3) bla (ApR) 编码 beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性; (4) lacZ基因的 5-端 序列，编码编码beta-半乳糖苷酶的N-端多肽，有了这个这个多肽片段，就可以菌落蓝白反应对重组质粒进行筛选,pBluescript II KS/SK,pBluescript SK,M13mp18 和 M13mp19 载体,单链、雄性专化的DNA丝状M13的衍生物。两个载体均为 7250 bp 长，其多克隆位点方向相反 。 在 E.coli 操作元 lac 区含 CAP 蛋白结合位点、 启动子 Plac、lac 阻遏蛋白结合位点和 lacZ基因的 5-端 序列(lacZ基因的第6-7个密码子被多克隆位点取代)。,M13mp18/19结构图,多克隆位点,Lambda噬菌体,Lambda噬菌体是一种大肠杆菌的温和性噬菌体。其 DNA 是线状的、双链的 (48502 nt)，两端的5-端有12 个碱基是单链的，碱基互补的。噬菌体DNA注射到菌体内后末端碱基互补而环化。在裂菌循环途径，噬菌体编码复制、溶菌和衣壳蛋白的基因表达。噬菌体DNA复制，复制品被切下来，包装到子代噬菌体粒体中。在溶原循环中，噬菌体基因的表达受到遏制，其DNA通过重组插入到细菌染色体中。,Lambda噬菌体唯一切点,Lambda噬菌体载体,cos质粒,是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点是可以用来插入较大的DNA片段，再转入细菌。,cos质粒载体,一个典型的质粒克隆技术涉及5步,1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 4) 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 5) 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选,克隆示意图,克隆示意图,1. 用限制性酶消化 DNA 样品,粘性末端,2.用限制性内切酶消化 质粒DNA,3.连接样品DNA和质粒DNA的消化产物,冷循环器,4.用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。,用氯化钙化学转化,用氯化钙化学转化,电激转化,一个电激转化程序,加 50-200ng DNA 到 40ul 电激感受态细菌中 将混合物放入一个预冷的电激杯中 施以脉冲电处理，脉冲长度预期值为 8 to 12ms 立即加1ml LB 培养液，在室温下振荡 2-4 小时。 分别取10ul 和 100ul 涂布在到两个加有抗菌素的LB 琼脂平板上， 保温培养1天。,5. 细菌在加有Amp+X-Gal的培养基上生长以进行筛选,连接会有三种结果，一是要插入的序列自连；二是切开的质粒重连；三是要插入的序列与质粒相连。第一种连接结果没有菌落形成。第二种连接结果表现为蓝色菌落。只有后一种结果是符合需要的，产生白色的抗氨苄青霉素菌落。,灭菌器,加IPTG和X-GAL,倒平板,划线,筛选结果,蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的 LacZ序列编码的功能性的 片段 白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上 LacZ序列上有插入片段,重组体筛选,筛选结果模式图,蓝菌落,蓝