影响pcr成功的因素

影响PCR成功的因素I,用户从检材中提取,试剂盒的核心技术，久经考验,很少出问题，质量可靠,核心技术之一，精心优化,用户提供，最低要求用去离子水,关键,模板DNA可能出现的质量问题,浓度不合适,太低,无扩增产物或者部分位点丢失,太高,出现非特异性扩增或者均衡性变差,纯度不够：含较多的PCR抑制剂,无扩增产物或者部分位点丢失,完整性不够：DNA发生严重降解,无扩增产物或者只能扩增出小片段,影响PCR成功的因素II,反应条件,已经过反复优化,PCR仪控温精度,重要，ABI 的PCR仪比较可靠,Matrix校正失败或没做校正的表现：,Genemapper分析后的图谱,Dye set,决定CCD上的哪部分区域被激活，相应部分的可见光被收集,各测序仪的性能参数,最常见,搭配苹果电脑，不能直接使用我们的试剂盒,自动灌胶，费胶,各试剂盒的组成,Goldeneye16A所选位点的特点,全部13个CODIS规定位点 PentaD和PentaE是5核苷酸重复的位点，相比4核苷酸重复的其它位点，stutter比例明显更低，有利于区分混合模板,Goldeneye16BT的一个使用特例,需要指出的是，O的另外一个等位基因O2，在261位没有缺失G，所以当本试剂盒检测到O/O2血型样本时，会误判为A/O型。 但是，迄今为止没有在中国人群和日本、韩国等亚洲人群中发现这一等位基因，并且在其他种族人群中频率极低，所以用本试剂盒检测中国人群ABO血型能够得到准确的分型。,16A和16BT对软、硬件的要求,软件要求：Genemapper软件 硬件要求：ABI 3100Avant，3100，3130，3130xl，3730，3730xl ABI 310测序仪因使用苹果电脑，必须用软件将原始数据转化成windows文件，再导入Genemapper才能分析 Genemapper3.2的安装要求：PC机，256M以上的内存。256M内存但使用集成显卡的电脑安装不上。,试剂盒使用过程中可能碰到的问题I,正常样本每个位点最多出现2个峰，如果多个位点出现2个以上峰，则肯定是污染了或者是混合样本,试剂盒使用过程中可能碰到的问题2,扩增后试剂盒中的Ladder污染到了扩增前,污染,试剂盒使用过程中可能碰到的问题3,有时出现的染料堆积峰，尚未解决，不影响判型,染料堆积峰,试剂盒使用过程中可能碰到的问题4,模板DNA浓度严重过量,试剂盒使用过程中可能碰到的问题5,模板浓度非常高，以至于产物浓度超过仪器检测限,试剂盒使用过程中可能碰到的问题6,模板DNA浓度过高，出现大量杂峰,试剂盒使用过程中可能碰到的问题9,模板量较低或模板已降解造成的，DNA降解成为较小的片段，故相对长些的片段无法得到扩增,大片段丢失,试剂盒使用过程中可能碰到的问题10,整体峰高偏低,模板浓度不够或者纯度不够,试剂盒使用过程中可能碰到的问题11,均衡性差，小片段明显优势扩增,模板浓度偏大的一种表现，ABI的ID试剂盒这一现象更加明显,试剂盒使用过程中可能碰到的问题12,等位基因失衡（同一位点2个峰高明显不同），模板浓度太低,试剂盒使用过程中可能碰到的问题13,电泳时毛细管中的杂质引起的杂峰,试剂盒使用过程中可能碰到的问题14,Taq酶在扩增完后，会在末端加上一个A碱基，但这个效率很难做到100%，当模板浓度过大或存在明显的PCR抑制剂时有时会出现加A不完全-本问题已基本解决,不加A峰,加A峰,15. 电泳时出现目的片断以外的其他杂峰,原因：主要原因是甲酰胺质量不好，或者是甲酰胺长期在4度放置有降解。 解决方案： 更换质量好的甲酰胺。（确定不是扩增产物。）,试剂盒使用过程中可能碰到的问题14,Taq酶在扩增完后，会在末端加上一个A碱基，但这个效率很难做到100%，当模板浓度过大或存在明显的PCR抑制剂时有时会出现加A不完全-本问题已基本解决,不加A峰,加A峰,16.出现电泳峰,说明：所出现的尖锐的小峰实际上是四种颜色都有的，位置不固定，杂乱无章，内标中相对明显，影响分析结果。当室温过高时明显会增多，可能是胶中有气泡，受热膨胀，易形成。严重影响分析结果的建议重新电泳。,16. 其他常见的电泳不好的现象,说明：内标峰值很低，样品峰值低不能作为扩增不好的依据。需要重新上样以 确定原因。,说明：内标并不均匀