仪器分析毛细管电泳法.ppt

第五章 毛细管电泳法,Capillary Electrophoresis,本章要求 了解电泳、淌度、电渗的概念 了解毛细管电泳仪的结构 了解六种毛细管电泳分离模式,毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（HPCE），是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的液相分离技术。 CE 实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。,5.1 基本概念和原理,在电解质溶液中，带电粒子在直流电场的作用下，以不同的速度或速率向其所带电荷相反电场方向迁移的现象。阴离子向正极方向迁移，阳离子向负极方向迁移，中性化合物不带电荷，不发生电泳运动。 利用这些带电粒子在电场中迁移速度的不同而达到分离的技术称为电泳。,1. 电泳,2. 毛细管电泳：CE,以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，利用被分析离子在电场作用下移动速率不同而达到分离的目的，主要用于分析在毛细管缓冲溶液中离解为离子的物质。,毛细管的内径比头发丝还细得多,10-30千伏电压,3. 淌度,淌度：单位电场下的电泳速度。 绝对淌度：在无限稀释溶液中（稀溶液数据外推）测得的淌度称为绝对淌度，0em,电泳速率：待测物从进样端到检测窗口的迁移速度，vem,em：cm2/(sV)； vem ：cm/s； E：V/cm,4. 电渗,毛细管内充满溶液 pH 3时，管内 Si-OH 电离 SiO- 基，毛细管壁带负电，与溶质界面上形成双电层。在双电层的扩散外层中，阳离子向阴极移动，带动溶液形成轴向流动。,在毛细管中电渗速度可比电泳速度大一个数量级，所以能实现样品组分同向泳动。正离子的运动方向和电渗流一致，最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳速度，在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。,离子的出峰次序为：正离子 中性分子 负离子,电渗流的作用：, 可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离。 改变电渗流的大小和方向，可改变分离效率和选择性，也是CE与HPLC相比能优化分离的重要因素。 电渗流的微小变化影响结果的重现性，控制电渗流恒定是CE分析关键所在。 电渗流在CE中起到像HPLC中的泵一样作用。,铂电极,缓冲溶液,高压电源,毛细管,5.2 毛细管电泳装置,1. 进样系统,电动进样；压力进样；扩散进样。 进样体积一般在纳升级。,2. 分离系统,毛细管： 熔融石英，长40100 cm，内径25100 m； 恒温系统：控制柱温变化在0.1； 高压电源：电流0300 A，电压030 kV (稳定性0.1%),3. 检测系统,4. 数据处理系统,紫外-可见检测器 ；激光诱导荧光检测器；电化学检测器。,5.3 毛细管电泳分离模式,6种分离模式： 毛细管区带电泳CZE 毛细管等速电泳CITP 毛细管等电聚焦CIEF 毛细管电色谱CEC 胶束电动毛细管色谱MECC 毛细管凝胶电泳CGE,1. 毛细管区带电泳 (CZE) 用CZE时，整个系统用一种缓冲溶液 (背景电解质)，根据各组分荷质比不同而分离。背景电解质仅起 传导电流的作用。 t 0 t 0,2. 毛细管等速电泳（CITP）,使用两种电解质：一种为迁移率较高的前导离子L电解质，一种为迁移率较低的尾随离子T电解质，被分离组分夹在L与T之间，以同一速度运动，由于迁移率不同而分离。,3. 毛细管等电聚焦 (CIEF) 基本操作步骤：进样、聚焦和迁移，用于生物大分子的分离。,毛细管等电聚焦电泳的运行过程 (a)进样；(b)聚焦；(c)迁移,4. 毛细管电色谱 (CEC) 分为填充柱和开管柱两种方式，可分离离子和中性分子，且可分离手性分子。,5. 胶束电动毛细管色谱 (MECC) 两相：流动的水相和起固定相作用的胶束相(准固定相)，被测组分由于在水相和胶束相之间分配系数的差异而分离。,5.4 毛细管电泳特点及应用,(1) 高分辨率：理论塔板数高达数百万块至数千万块。 (2) 高灵敏度：可检测出低至10-20 mol浓度的物质。 (3) 高分析速度：可3 min内分离30种阴离子；1.7 min内分离19种阳离子；4 min内分离10种蛋白质。 (4) 试样用量少：仅需几nL (10-9 L)的试样。 (5) 仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升。 (6) 自动：CE是目前自动化程度最高的分离方法。 (7) 通常使用水溶液，对人和环境无害。,1. 优点,(1) 进样不够方便。 (2) 分析阴离子时，出峰时间较长。电渗会因样品组成而变化，影响分离重现性。 (3) 光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰。,2. 缺点,毛细管电泳与高效液相色谱比较： 操作简单，试样量少。 分离效率高，成本低。 迁移时间的重现性、进样的准确性和灵敏度比HPLC差。,3. 应用,毛细管电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，在临床医学等领域也有较多应用，如临床疾病诊断、临床蛋白分析、临床药物监测、代谢研究、病理研究、PCR产物分析、DNA片段及序列分析等。,可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验。,除分离生物大分子（肽、蛋白、 DNA、糖等）外