目标产品的蛋白质分析检测

目标产品的蛋白质分析检测技术与质量控制,曹纯洁,2,主要内容,蛋白质含量和纯度 氨基酸的分析 蛋白质的分子量测定 蛋白质的等电点 肽谱 蛋白质突变点的分析 蛋白质的二硫键的分析,3,一、蛋白质含量和纯度,蛋白质浓度测定的方法：凯氏定氮法（繁琐）、TCA比浊法、双缩脲法（需样品量大,不够灵敏）、福林-酚法和紫外线法。 已知摩尔消光系数时，可准确的计算出蛋白浓度：公式A=CL。 L为内径。C为摩尔浓度。 摩尔消光系数（ ）的定义为：在特定条件下，一定波长的光，光径为1.00cm时，通过所含吸光物质的浓度为1.00 mol/L时的吸光度。 未知摩尔消光系数时，可测280nm和260nm光吸收值，用公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260 =1.45A280-0.74A260,4,考马斯兰G-250法：此试剂在酸性条件下与蛋白反应，当吸收峰由465nm转移到595nm，灵敏度高，测定蛋白的浓度范围广。 遗传工程产品蛋白质的纯度要求：95%、99%、99.9%。 常用鉴定蛋白纯度的方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-PAGE、毛细管电泳（CE）、等电聚焦（IEF）、HPLC（包括凝胶过滤、各种反相HPLC、离子色谱、疏水色谱）,5,五种蛋白质测定方法比较,6,新的方法：如质谱法，仅pmol的样品就能测定，同时能给出分子量。 注意：只用一种鉴定蛋白纯度的方法是不够，往往几种 （方法，机理）结合使用。,7,二、氨基酸分析,检测法的种类： 氨基酸进行UV检测只能利用羧基（-COOH）在200210nm处的吸收。一部分具有苯环的氨基酸也可在250280nm检测，但是，一般对原物质（氨基酸）进行高灵敏度、良好选择性的分析比较困难。 因此，很早以来就使用衍生法，利用许多氨基酸构造中存在的氨基（-NH2，-NHR），使用与该基团可进行选择性反应的衍生试剂。 检测的仪器：HPLC或氨基酸分析仪,8,两类方法： 柱后反应法： 将游离的氨基酸经色谱柱分离后，氨基酸再与显色剂（茚三酮吸光度检测、荧光胺、邻苯二甲醛荧光检测）作用，然后导入检测器。 优点： 反应可自动化，定量定性、重现性优异。 由于反应前试样成分在柱中分离，“杂质”被去除，比较稳定。,9,柱前衍生法： 将各种氨基酸和荧光试剂先作用生成衍生物，再分离，直接检测衍生物的荧光。 特点： 反应系统小，试剂用量少。 可使用高价格的试剂，低背景，可提高灵敏度。 即使检测出未反应试剂，但经柱分离，也不会影响检测。,10,氨基酸水解方法： 通常是5.7mol/L HCl真空状况下110水解24h，也有在150 下快速水解4h。 不同条件下，各种氨基酸的回收有所不同，且有的氨基酸会遭受破坏（如色氨酸）。 保证氨基酸分析准确性的方法： 过去用胰岛素为标准样品来判断， 近年来采用“测试肽法”，即将20种常见氨基酸人工合成一个20肽。然后水解，每种氨基酸残基出现频率是1，易于校正回收。,11,新的方法： 毛细管电泳，仅需ng的量，分辨率和准确性均比SDS-PAGE好。 质谱，灵敏度和准确性都很好，精确度达0.01%。,12,13,三、蛋白质分子量的测定,早期方法：超离心、光散射法，需较高级仪器和较多的样品，现很少使用。 凝胶过滤法测蛋白质分子量。如Sephadex系列（G75、G100）等HPLC凝胶过滤系统。测定是完整蛋白质分子量。 实验室常规方法：SDS-PAGE，用量约1ug，误差为5-10%，但方便。测定蛋白质亚基的分子量。,14,毛细管等电聚焦电泳-电喷雾质谱技术（CIEF-MS）：分辨率极高，能分辨的等电点差异小于0.04pH。 一些标准样品用此法分析可发现亚型（分子量完全一样，等电点不同）的存在。 如细胞色素C两个亚型分别为9.60、9.55。一般的方法根本无法分辨。,15,四、蛋白质的等电点,等电聚焦法：可以测定蛋白质的等电点，同时可鉴定蛋白的纯度。 毛细管等电聚焦法：能测定偏碱性的蛋白质的等电点，如天花粉蛋白的等电点测定。,16,五、肽谱,肽谱技术：是指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析或制备。 1、裂解方法：用酶或化学法裂解蛋白质成肽段。 酶解： 胰蛋白酶（切碱性氨基酸如Arg,lys的C端） Lys-C内肽酶只作用于Lys-X键； 梭菌蛋白酶只作用于Arg-X键。 V8蛋白质只专一作用于负电性氨基的C端（Glu,Asp）；在pH=4条件下，V8只作用于Glu-X键。,17,化学裂解： 最常用的是溴化氰，作用于Met C端和其次一个AA的肽键。如-干扰素有4个Met，可被裂解成5肽段。 BNPS-3甲基吲哚、N-氯代琥珀酰亚胺作用于Trp-X键上； 2-硝基-5硫氰基苯甲酸作用在X-Cys键上； 羟胺作用在Asn-Gly键上。,18,2、肽谱分析 肽谱分析一般用HPLC和CE来进行： HPLC主要是用RP-HPLC根据肽的长短和疏水性来分离。 当肽亲水性强，用HPLC不能带留在柱内，达不到分辨效果；或当肽疏水性很强，粘在柱上洗不下来时，可用CE来进行。 SDS-PAGE：当裂解成的肽段较大时，可进行。 当对于小分子肽时，往往无法分辨。 质谱分析蛋白质的酶解产物，多肽出现先后按分子量大小排列。,19,六、蛋白质突变点的分析,例子：人白细胞介素-2的突变点分析。133AA，第125是一游离Cys，第58位和第105位半胱氨酸形成二硫键（活性必需）。 鉴定IL-2的蛋白质工程(Cys-Ser/Ala)突变点：用TPCK-胰蛋白酶水解后，进行RP-HPLC分离分析。 天然IL-2和新型IL-2的酶解图谱比较寻找有差别的肽进行顺序分析； 荧光标记Cys残基，比较标记前后新型IL-2酶解图谱的差别，从而鉴别出点突变的肽； 同位素标记法； 利用IL-2只有一个色氨基酸，280nm主要是色AA吸收其次是酪AA和苯丙氨酸，酶解后分别用214nm和280nm检测，可找到含色AA的肽段用CE确定为均一AA序列分析证实新型IL-2的Ser（125）取代了Cys。,20,酶解后，用液质分析，寻找与理论值分子量不一致的肽段。,21,新的方法：CE-MS联机来检测IL-2突变点，更快速和准确。,22,七、蛋白质的二硫键分析,二硫键的错配，生物活性只有原来的1/400。 分析方法： IL-2（3个Cys）：用同位素标记，pH=8.5用3H-碘代乙酸处理IL-2，只有游离的巯基才与其作用，然后还原，再用14C-碘代乙酸烷化。故