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2010年版药典一部 生物安全性检查和生物活性测定法介绍,张德波 成都市食品药品检测心(成都市药检所),2010年版药典一部安全性检查内容介绍,凡例 动物试验(四十五) 成方制剂和单味制剂 四个品种 附录 A 热原检查法 D细菌内毒素检查法 E异常毒性检查法* G过敏试验检查法* H 溶血与凝聚试验* 附录 B 中药注射剂安全性检查法指导原则 附录 C 中药生物活性测定指导原则,凡例-动物试验,2005年版一部 动物品系、年龄、性别应符合规定。 尽量取代动物试验，减少动物使用量。,2010年版一部 动物应健康。 动物品系、年龄、性别、体重应符合规定。,凡例-动物试验,实验动物的要求 应是取得实验动物生产资质的单位生产,动物应有合格证。 动物应品系、年龄明确。 动物性别、体重应符合试验需要。 应有严格检疫制度。 使用前应正常饲养至适应使用环境。 应有动物处理制度。,成方制剂和单味制剂,止喘灵注射液 异常毒性 注射用双黄连（冻干） 溶血与凝聚、热原 清开灵注射液 异常毒性、热原、溶血与凝聚 注射用灯盏花素* 热原、过敏试验、降压物质、异常毒性、溶血与凝聚,附录 A 热原检查法,热原（Pyrogen ） ：系指某些药品中含有的能引起体温升高的杂质。 来源：临床上能够引起发热的物质如细菌内毒素、病毒、细菌，以及其他一些微生物、类固醇等。 存在：无所不在，水、灰尘、生产药品的器皿中都存在热原质。 性质：细菌内毒素是细菌细胞壁的一种化学成份，主要为脂多糖，致热性极强，具有耐热、耐酸碱、耐氧化剂，不易破坏，同时具有水溶性、不挥发性、滤过性，在药品生产过程中不易去除。 不良反应：引起人体发冷、寒颤，然后引起发热，甚至昏迷和休克。,附录 A 热原检查法,2005年版药典,供试用家兔 体重 1.73.0kg,雌者应无孕。 饲养：预测前7日的规定。 淘汰： 饲养不正常者 供试品判为不合格者 使用超过10次者,2010年版药典,供试用家兔 体重 1.7kg以上,雌者应无孕。 饲养：预测前7日的规定。 淘汰：饲养不正常者 供试品判为不合格者 不同点：体重无上限 使用次数不再规定10次 建议：,附录 A 热原检查法,家兔预选 未曾使用过的家兔。 供试品合格，但升温 0.6，休息达2周以上。 3周内未曾使用的家兔。 预选条件应与正式实验一致。 休温应在38.0 39.6。 每一只8次测温最高与最低温差应不大于0.4,附录 A 热原检查法,2005年版药典,试验环境条件 实验室与饲养室温差不得大于5 ，且在17 25之间。 实验过程中温度变化3,2010年版药典,试验环境条件 实验室与饲养室温差不得大于3 ，且在17 25之间。 实验过程中温度变化3,附录 A 热原检查法,实验操作过程 试验前准备工作:实验兔、相关器具除热原、供试品 正式实验 家兔正常体温测定:体温38.0 39.6,且两次相差0.2。 供试品液准备:注射前配制，温热至约38 。 分组：三只家兔温度最好相近，组内温差不得过1 注射给药：15分钟内注射完毕，注意止血。 测定给药后的体温 计算体温变化（升温为负值时以0计，注意数值修约） 数值修约：四舍六入五成双 12.149812.1; 12.16 12.2 12.150001 12.2; 12.15 12.2; 12.45 12.4 得出结论,附录 A 热原检查法,结果判断（2005版）,初试合格 3只均0.6 ,且总和1.4 需复试 3只中有一只 0.6 ,或均不超过0.6 ，但总和1.4 初试不合格 3只中 0.6 的超过一只。 复试合格 5只中 0.6 不超过一只，或8只总和3.5 复试不合格 5只中 0.6 超过一只，或8只总和 3.5 ,结果判断（2010版）,初试合格 3只均0.6 ,且总和1.3 需复试 3只中有一只 0.6 ,或总和 1.3 初试不合格 3只中 0.6 的超过一只 复试合格 5只中 0.6 不超过一只，或8只总和3.5 复试不合格 5只中 0.6 超过一只，或8只总和 3.5 ,附录 A 热原检查法,家兔的重复使用 供试品合格的家兔 至少休息48小时。 升温 0.6 的家兔，至少休息2周以上，且通过预选合格。 供试品不合格的家兔淘汰 建议：关于升温的家兔 关于降温的家兔,附录E 异常毒性检查法,异常毒性检查 初试动物要求：1720g，5只。 复试动物要求：1819g，10只。 给药时间：各论下有规定者按各论项下规定时间， 否则按每只45秒。 结果观察：给药后观察48小时。 结果判断：以动物是否死亡作为判定指标。,附录F 降压物质检查法,降压物质检查法 对照品贮备液的配制： 磷酸组胺折算成组胺的系数0.342。 规定配制成1.0mg/ml，但最好采用定容方法。 48 保存3个月内使用。将有沉淀析出改为经验证活性符合要求，验证方法：猫注射0.1g/kg，血压下降均值应不小于2.67kpa。 对照品稀释液的配制： 配制浓度应根据供试品给药剂量（体积）来确定。 实验前的准备工作：对照品、猫、仪器、试验通路联接、手术器具、麻 醉剂、供试品 猫的麻醉及手术注意事项 猫灵敏度测定： 0.05g/kg、 0.1g/kg、 0.15g/kg 供试品降压物质检查：ds dT dT ds 异常情况的处理:动物呼吸困难、动物有苏醒迹象、血压突然下降,附录G过敏试验检查法,过敏物质检查法 动物要求: 250 350g，雌者应无孕，6只。 致敏：腹腔注射给药0.5ml/只，间日一次，连续3次。 激发：首次致敏注射后的第14日和第21日，静脉注射1ml/只。 结果观察：激发后观察30分钟。建议观察60分钟。 结果判断：如有一只动物出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、紫癜和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐、休克，死亡现象之一者，判定供试品不符合规定。 保证实验可靠的几点建议： 设置空白、适当增加动物数、激发前的观察、饲养问题 对该试验的几点思考：实验剂量、实验动物数、观察指标。,附录H 溶血与凝聚检查法,2%兔红细胞混悬液配制 操作法 温育: 370.5 , 3小时。 结果判断 几个问题 试验剂量问题，结果判断问题 乳状液型注射液实验观察问题,附录D 细菌内毒素检查法,细菌内毒素（Endotoxin） 革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，具有多种生物活性， 其化学结构是脂多糖（LPS）。 生物活性 致热性 、与鲎试剂反应 特点 广泛存在、非常稳定、具有疏水性和亲水性的两性分子 致热活性的高度不均一性 细菌内毒素标准品 参考标准品（国际 国家标准品） 国家工作 标准品 企业工作品,附录D 细菌内毒素检查法,鲎试剂 鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成 规格: 0.1ml; 0.5ml. 灵敏度（） 对鲎试剂灵敏度的正确理解。 鲎试剂的灵敏度复核 细菌内毒素工作标准液的配制：2、1/2、1/4 鲎试剂的复溶：按标示规格复溶，不得稀释或浓配。 加样操作 结果判断,附录D 细菌内毒素检查法,灵敏度复核结果 实验成立与否的判断 结果计算方法:c=anitlg(X/4) X为反应终点的对数（lg)值。 不需要计算的几种情况,附录D 细菌内毒素检查法,细菌内毒素的常规检查 例1：取本品，用细菌内毒素检查用水至少稀释20倍后，依法检查，本品每1ml中含有的内毒素应小于1. 25EU。 L=1.25EU/ml MVD=CL/-20=11.25EU/ml/ =0.625EU/ml 供试品液配制： 样品液 稀释10倍 稀释20倍。 内毒素工作标准品配制 120EU/支 ，150601-200963。 120EU（1支） 1.0ml（ 120EU/ml) 120EU/ml 0.25EU/ml（4） 0.125EU/ml（2） 供试品阳性对照液 内毒素液 0.5ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml（2，20倍稀释液） 上样品10倍稀释液 0.5ml 例2：某样品规格1g 细菌内毒素 取本品，依法检查，每1mg中含内毒素量应小于0.1EU 介绍一种简便的操作方法,中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草,静脉用注射剂 热原、异常毒性、溶血与凝聚、过敏反应、降压物质（非降压药）。 可考查建立细菌内毒素检查法。 肌肉用注射剂 异常毒性、过敏反应。,中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草,热原标准起草 剂量设定：临床成人1小时内最大用量的35倍。 考虑几点: 毒性、干扰、药物本身具有解热性问题。 供试液浓度确定：考虑两点: 溶血、刺激性。 注射体积确定： 标准文字表述： 异常毒性标准起草 剂量设定：应低于最低致死量，1/3LD1或者1/4LD50。 建议：最好低于明显出现药物本身毒性的剂量。 根据临床用药量来确定。 标准文字表述：,中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草,降压物质检查标准起草 本身为降压药物不用设置降压物质检查标准。 剂量设定：指导原则定得太宽，操作性很强。 无降压作用的药品： 临床单次用量的1/55倍； 有一定降压作用的药品：最大无降压反应的1/4 1/2。 供试品临床原液注射1ml/kg无降压反应，可以此作剂量。 建议：按临床用量来设定，考虑毒性问题。 供试液浓度确定：溶血、刺激性。 给药体积确定： 标准文字表述：,中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草,过敏反应标准起草 豚鼠毒性试验 剂量设定：在考虑毒性的基础上，剂量应尽可能大， 同时考虑临床用量。 致敏次数及激发时间：应当作研究，而不是完全按试验 方法规定次数与时间来操作。,中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草,溶血与凝聚标准起草 实验方法问题：取样量、供试液。 结果判断问题：振摇引起的争议。 个人提出的修改方法 建议以此作为内控标准。 供试液配制 试验剂量 结果观察 结果判断,中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草,细菌内毒素检查标准起草 举例：某中药注射液 用法与用量静脉滴注：一日2040ml，以10%葡萄糖注射液200ml 或氯化钠注射液100ml稀释后使用。 （一）内毒素限值确定：L=K/M 5EU/（kg.h) = = 7.5EU/ml 40ml/60kg.h 需要考虑的因素：5EU/（kg.h)只是理论数值，以此给家兔，有一半体温上升； 临床联合用药；注射器、输液器含内毒素，人体内含有的内毒素。 最后可以确定内毒素限值为 L=4EU/ml。 *体表面积给药的计算：中国人体表面积按1.62m2计算。 比如：某药临床人用量为100mg/m2 则 100mg/m 21.62m2=162mg 162mg/60kg=2.7mg/kg,中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草,细菌内毒素检查标准起草 （二）预试验 供试液配制成一系列浓度：可采用对倍稀释法。 原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍稀释液 鲎试剂（TAL） 灵敏度为 细菌内毒素工作标准品液配制：2浓度 加样试验 编号 原液 2倍 4倍 8倍 16倍 32倍 64倍 128倍 2内毒素 BET水 ,中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草,细菌内毒素检查标准起草 预试验结果 编号 原液 2倍 4倍 8倍 16倍 32倍 64倍 128倍 2内毒素 BET水 （三）正式实验 比如预试验稀释16倍就可能没有干扰作用。 鲎试剂确定 =0.25EU/ml 细菌内毒素液配制： 2 、 、1/2 、1/4四个浓度 加样操作,中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草,供试液组 内毒素 0.5 0.25 0.125 0.0625 阴性对照 ,BET水组 内毒素 0.5 0.25 0.125 0.0625 阴性对照 ,中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草,细菌内毒素检查标准起草 正式实验结论： （四）标准起草 供试液:PH最好在68, 标准规定用缓冲液或酸碱来调节PH值 建议:能用BET水稀释达到要求的就不用缓冲液或酸碱调节 （五）常规检查（验证） (六)介绍一种简单的半定量法 比如:某透析液L=2EU/ml,合格.想要了解大致内毒素含量。 假设样品液即无干扰作用。则 鲎试剂 1EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.0625EU/ml,2010年版一部注射剂安全性检查介绍,总 结 广义的注射剂安全性 狭义的注射剂安全性 2010版药典一部安全性检查的特点： 变化大，增加多，剂量要求更明确 安全性检查还存在的问题 方法并不完善 剂量设定要求上还存在不足,中药生物活性测定指导原则,生物活性 也可以说就是药物的有效性。 中药生物活性成份的筛选 中药提取分离，精制后，通过药理药效学试验进行筛选。 通过查阅已有的研究资料来确定。 目前复方中成药标准中含量测定成份未必就是生物活性成份。,中药生物活性测定指导原则,中药生物活性测定 就是通过测定生物效应，用统计的方法得出生物效价或生物活性大小的一种方法。 举例：缩宫素效价测定 中药生物活性测定的重要性 含量很高，但未必就存在生物效应。 举例：甘露聚糖肽含量测定与活性测定,中药生物活性测定指导原则,中药生物活性测定的基本原则 符合药理学研究基本原则 随机、对照、重复；作为标准还应相对简单、易操作。 举例：缩宫素效价测定量反应平行线测定随机区组设计（2，2）法 A、B、C、D， B、C、D、A， C、D、A、B， D、A、B、C 绒促性素效价测定量反应平行线测定随机设计（3，3，3）法 体现中医药特点 拟建立的测定指标应与该中药的“功能主治”相关。 一点个人看法 品种选择合理 选的品种功能主治应明确，优先考虑症明确的品种。 。方法科学可靠 优先考虑效价测定，其次考虑生物活性测定。,中药生物活性测定指导原则,基本内容 1、实验条件 试验系选择 根据中药的药效来确定。 供试品选择 工艺稳定，质量合格。 标准品或对照品 2、 实验设计 设计原理 客观、专属性强、重现性好，能反应功能主治 设计类型 效价测定、活性测定。 剂量设计 效价测定应与标准品或对照品等效。 生物活性测定应产生明显的生物效应。 给药途径 最好与临床一