生物化学--第十一章DNA复制RNA转录-转录.ppt

第二节 转录,转录(transcription)： 以DNA为模板，根据碱基配对的原则合成与DNA互补的RNA的过程。,1、相同点： 都需要模板 都分为三阶段 合成方向都是5 3 都形成磷酸二酯键,一、转录与DNA复制的比较：,2、转录DNA复制的不同点,底物不同 转录不需引物； 不对称转录 发生时间、空间等有选择性,二、DNA指导下RNA聚合酶：,（一）RNA聚合酶特性,四种核苷三磷酸（ATP、GTP、CTP、UTP）为底物； 模板以双链状态下活性最大； 聚合酶无校对功能； 无需引物，方向5 3 需要模板,（二）酶的分类与构成,大肠杆菌的RNA聚合酶,大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的功能,酶类,分布,产物,-鹅膏蕈碱 对酶的作用,分子量,反应条件,I,核仁,核质,核质,rRNA 5.8SrRNA 18SrRNA 28SrRNA,mRNAsnRNA,tRNA 5SrRNA,不抑制,低浓度抑制,高浓度抑制,500 000 700 000,700 000,_,低离子强度,要求Mg2+或Mn2+,高离子强度,高Mn2+浓度,真核细胞的RNA聚合酶,同样，真核RNA聚合酶无校对功能。,三、大肠杆菌的转录,（一）相关概念 1.链的名称 2.转录单位：一个转录事件从起始到终止的DNA区间称一个转录单位。（即从启动子到终止子之间的DNA序列） 3.转录起始点：指第一个核苷酸掺入的DNA上的位点 +1,4.启动子： RNA多聚酶能识别、结合，开始转录的一段DNA序列,大肠杆菌RNA聚合酶的启动子,转录起始位,(pribnow box),-35 区,-10 区,5、终止子(terminator),终止子：提供转录终子信号的DNA序列称为终止子，有两类：依赖r -因子的终止子和不依赖r -因子的终止子。 终止因子：协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（或蛋白质）。 通读：RNA聚合酶越过终止子继续转录的现象称为通读，通读是由于终止子被特异性的因子抑制产生的。 抗终止因子：引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。,(二)转录过程 1.起始,利用足迹法（footprint）和DNA测序法可以确定启动子的序列结构.,足迹法示意图,s70 for standard promoters; s32 for heat-shock promoters; s54 for nitrogen-starvation promoters,Standard Heat-shock Nitrogen starvation,大肠杆菌不同的因子识别不同启动子:,2.延长 因子循环,3.终止 不依赖r -因子的终止子：,依赖r -因子的终止子的终止反应：,r -因子：含六聚体的寡聚蛋白，具有依赖RNA的NTP酶活性，它结合于新生RNA上，借助与水解NTP产生能量推动RNA聚合酶向前移动，当酶遭遇终止子时暂停前进， r -因子追上酶，与酶相互作用释放RNA。还具有RNA-DNA解螺旋酶活性。,调节序列,起始子,GC box,CAAT box,真核生物编码蛋白质的基因的启动子的一般特性,真核RNA聚合酶的启动子,真核RNA聚合酶需要许多其它蛋白因子,真核RNA聚合酶和转录因子在启动子上的装配,三、RNA生物合成的抑制剂（之一）：模板抑制剂,烷化剂：使DNA发生烷基化，发生在G-N7，A-N1、N3 N7 ；C-N1。易引起嘌呤的水解，在DNA上留下空隙干扰复制或转录；或引起碱基错配。 放线菌素D：放线菌素D与DNA形成非共价的复合物，抑制其模板功能（低浓度抑制转录，较高浓度抑制复制）。具有类似作用的还有色霉素A3 、橄榄霉素、光神霉素。 嵌入染料：可插入双链DNA分子相邻的碱基对之间，一般具有芳香族发色团。溴化乙锭（EB）是一种高灵敏的荧光试剂，常用来检测DNA和RNA。与DNA结合后抑制其复制和转录。,放线菌素 D：模板抑制剂,放线菌素D的结构与作用,RNA生物合成的抑制剂（之二）：,嘌呤和嘧啶类似物：人工合成的碱基类似物能够抑制和干扰核酸的合成。如：,SH,作为代谢拮抗物抑制合成酶类或直接掺到核酸分子中，形成异常RNA或DNA。,F,RNA 聚合酶抑制剂（之三）：RNA聚合酶抑制剂,（2）利链霉素：与细菌RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中RNA链的延长反应。,（3）-鹅膏蕈碱：抑制真核生物RNA聚合酶活性。,（1）利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶活性。利福平可以高效抑制结核杆菌，杀死麻疯杆菌，在体外有抗病毒作用。,第三节 RNA转录后的加工,原核生物RNA的加工 真核生物RNA的加工,转录后加工： 指在细胞内，由RNA聚合酶合成的初始转录产物需要经过一系列的变化才能转变为成熟的RNA分子的过程。,（一）、rRNA前体的加工,甲基化,6500个核苷酸,核酸内切酶RNase、P,核酸外切酶,一、原核生物RNA的加工,（二） tRNA的加工,三、真核生物RNA的一般加工,转录初始产物（hnRNA）,（一）mRNA前体的加工,真核mRNA前体的加工步骤:,（1）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列）拼接上，真核生物一般为不连续基因。,加工包括：,（4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。,（3）5端连接“帽子”结构（m7G5ppp5NmpNp-）；,（2）3端添加polyA “尾巴”；,真核mRNA的5“帽子”加工,多聚腺苷酸聚合酶,真核生物mRNA 3-“尾巴”的加工,内切酶,加尾信号,因发现断裂基因而获1993年诺 贝尔生理学奖的Richard J Robert and Phllip A Sharp,（二）真核rRNA前体的加工,（三）真核tRNA前体的加工,四、RNA的拼接机理,大多真核生物基因是断裂基因，即含有内含子。断裂基因的转录产物必需通过拼接，去除插入部分（内含子,intron），使编码区（外显子,exon）成为连续序列。这是基因表达的重要环节。内含子的结构多种多样，拼接机制也是多种多样的。,RNA的拼接方式,类型内含子的自我拼接：核酶的作用,类型内含子的自我拼接：核酶的作用,hnRNA的拼接：核内小RNA(SnRNA)与蛋白质组成核糖核蛋白体（snRNP）的作用(类型内含子的切除）。,核tRNA的拼接：酶促拼接,核酶的发现：,1981年Cech T在研究四膜虫(Tetrahymena thermophila) rRNA前体拼接过程中发现，此类的拼接无需蛋白质的酶参与作用，它可自我催化完成。Cech称具有催化功能的RNA为核酶（ribozyme）。1989年cech T和Altman S共同获诺贝尔化学奖，Altman S的贡献是发现Rnase P中的M1RNA单独也具有催化功能 。核酶的发现改变了酶的化学本质是蛋白质的传统观念，被认为是近二十年来生物化学领域中最令人鼓舞的成就之一。,The M1 RNA in ribonuclease P is catalytic,The intron in the pre-rRNA of Tetrahemena is self-spliced,因发现核酶而获诺贝尔奖的两位科学家：,1、类型内含子的自我拼接：,借助与鸟苷酸或鸟苷的作用，内含子自我催化，通过三次转酯反应完成拼接，切下L19RNA。,L19RNA或L19 IVS（含395个核苷酸）,2、类型内含子的自我拼接,也是由内含子自我催化完成，但转酯反应无鸟苷的参与，两次转酯反应后内含子形成套索结构而切下。,细胞内存在许多种类的小分子RNA，其大小在100300个核苷酸，称为核内小RNA（Small nuclear RNA,snRNA）。U系列的snRNA中尿嘧啶含量较高。因而得名。这些小RNA 与多种蛋白质结合形成snRNP参与核内RNA 的加工。U1、U2、U4、U5、U6结合形成的snRNP参与hnRNA的拼接，U3 snRNP参与rRNA的拼接。,U2hnRNA含与分支处互补序列,U1hnRNA含与内含子3-端互补序列,核酸内切酶,环磷酸二酯酶,激酶,激酶,连接酶,磷酸酯酶,4、核内tRNA前体的酶促拼接（内含子的切除）,RNA拼接的意义,1、RNA的拼接是生物机体在进化历史中形成的，是进化的结果； 2、RNA的拼接是基因表达的重要环节。RNA转录后通过拼接而抽取有用信息，形成连续的编码序列，并可通过选择性拼接而控制生物机体生长发育。因此，这是真核生物遗传信息精确调节和控制的方式之一。,RNA拼接现象的发现，给生物学家一系列令人困惑的疑问：为什么生物机体要先转录内含子，然后将其切除？RNA合成后再拼接是一个非常耗能的过程，对细胞其收益是什么？内含子由何而来？内含子有无生物功能？,围绕以上问题，提出一些看法或观点，但争议很大，目前尚无定论：,5、内含子和外显子是相对的，有些内含子具有编码序列，能产生蛋白质和功能RNA。如型内含子能产生核酸内切酶，型内含子能产生核酸内切酶和逆转录酶。以帮助内含子的转移。,RNA拼接的意义,3、基因由模块装配而成，模块间的间隔序列也就演变成内含子，因此外显子和内含子有着同样的古老历史。而现今存在的几类内含子也各自有其起源和进化历史，从它们的拼接方式和分布可以大致推测其起源时间。,4、RNA的拼接主要存在于真核生物，原核生物极为少见，但并非完全没有。一种合理的解释是原核生物为适应快速生长的需要，在进化中已将内含子丢掉。事实上，快速生长的单细胞如酵母，其编码的基因也几乎没有内含子。然而内含子的存在和拼接作用对生物机体的进化十分重要。,不同RNA拼接方式导致一个基因多种产物,降钙素,甲状腺,脑,降钙素基因相关肽,返回,真核生物复杂转录产物的两种不同的剪接方式,第四节 逆转录（reverse transcription ）,1970年Temin等和Baltimore分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。,定义: 以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA的过程称为逆转录，由逆转录酶催化进行。,用特异抑制物（放线菌素D）能抑制致癌RNA病毒的复制，而对一般RNA病毒的复制无影响。已知放线菌素D专门抑制以DNA为模板的反应，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假说。,以前病毒形式整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化单链病毒RNA RNA-DNA杂交分子 双链DNA（前病毒）,逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿53方向合成DNA，底物为四种dNTP,并要求短链RNA作引物。,逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性： RNA指导的DNA聚合酶活性； DNA指导的DNA聚合酶活性； 核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿53方向起核酸外切酶的作用； 无校对功能，错误率高，易产生变异。,致癌RNA病毒的逆转录过程,逆转录病毒的生活史,不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。,1983年,发现人类免疫缺陷病毒(human immune deficience virus,HIV),感染T淋巴细胞后即杀死细胞,造成宿主机体免疫系统损伤,引起艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)，该病毒为逆转录病毒。,逆转录酶发现的理论与实践意义：,因发现逆转录病毒的遗传物质而获1975年诺贝尔奖的三位科学家,（1）病毒RNA可充当mRNA，利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白和复制酶的亚基。,概念：RNA病毒以自身RNA为模板合成与自身RNA完全相同RNA分子的过程称为RNA的复制。,四、RNA 的复制,（噬菌体Q和灰质炎病毒）,（2）复制酶的亚基与来自宿主细胞的亚基自 动装配成RNA复制酶，进行RNA复制，通常以分子中 单链RNA为模板（正链），复制出一条新的RNA链 （负链），然后以负链为模板复制出大量正链，再 与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。,两个阶段:,RNA复制酶的催化性质:,以四种NTP为底物； 专一性地选择病毒RNA为模板； 按5 3的方向合成病毒RNA； 无外切酶活性（即无校对功能）。,病毒RNA的复制方式:,1、病毒含正链RNA：进入宿主细胞后先进行病毒RNA复制酶和有关病