医学分子生物学 2015-第二章 rna.ppt

第四节 调节基因表达的RNA,一、RNA干扰（RNA interferenc，RNAi）的发现,1990年， Napoli矮脚牵牛花实验,Plant Cell,1990,1995年，郭苏和导师坎菲思（Kenneth Kemphues）,Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans,1998年，安德鲁法尔（Andrew Z. Fire）,克雷格梅洛（Craig C. Mello）,Nature, 1998,秀丽新小杆线虫par-1基因Cell,1995,第一篇以“RNA 干扰”命名该现象及阐述机制的文章,2001年，托马斯塔什尔（Thomas Tuschl）,2001年，美国科学杂志评选 年度十大科学进展,Elbashir SM and Tuschl T. Nature,2001,第一篇探讨哺乳动物细胞中RNA干扰现象的文章,Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells,2002年，美国科学杂志评选 年度十大科学进展之首,2001年，Bernstein E 分离鉴定果蝇Dicer,Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference,Nature,2001,2006年，Jennifer Doudna X射线衍射晶体分析技术,Structure basis for double-Stranded RNA processing by Dicer,Science,2006,纯化并结晶 Giardia intestinalis Dicer,2006年，美国斯坦福大学医学院 安德鲁法尔（Andrew Z.Fire）,“for their discovery of RNA interference gene silencing by double-stranded RNA“,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006,Andrew Z. Fire,Craig C. Mello,马萨诸塞大学医学院 克雷格梅洛（Craig C.Mello）,获得诺贝尔医学和生理学奖,二、RNA干扰,(post-transcriptional gene silencing，PTGS)的一种形式。,RNAi是指外源双链RNA进入细胞后，引起与其序列同源,的特异基因mRNA 降解的现象,属于转录后基因沉默,antisense复制、转录翻译水平,knock-outDNA水平,RNAi转录后水平,基因沉默,优点： 方便快捷, 高特异性,功能：分析特定基因在细胞内的功能。, 高效性, 作用广泛性,“Immune System” of the Genome, Antiviral Defense Suppress Transposon Activity Response to Aberrant RNAs,三、RNA干扰机制,1、启动阶段：,dsRNA被Dicer逐步切割成siRNA （ small interfering RNA ）,2、效应阶段:, Risc形成： siRNA与蛋白质聚集形成Risc （ Risc，RNA-induced silencing complex）, Risc激活： siRNA双链解开。, 激活的Risc定位到同源mRNA上， 降解该mRNA,四、RNA干扰过程中的关键元件,1. dsRNA（double strand RNA）, RNA病毒：ssRNA,dsRNA,RNA指导的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）,RdRp, 人工导入dsRNA,2. Dicer,RNase III家族成员核酸内切酶，特异性识别并切割dsRNA,dsRNA结合结构域 （ dsRNA-binding domain,dsRBD）,RNase III催化结构域,解旋酶结构域（helicase domain）,dsRNA,siRNA,Dicer,a front view of the crystal structure of Giardia intestinalis Dicer,ATP依赖,PAZ结构域,3. siRNA duplex,结构：双链,3端突出2个核苷酸,2125个核苷酸,21 nucleotides,2 nt overhang,4. Risc（RNA-inducing silencing complex）,RNA诱导的沉默复合物,组分： siRNA,Ago（Argonaute protein family）结合募集siRNA,RNA helicase（RNA解旋酶）形成单链siRNA,Risc,Risc,正义链,反义链,反义链,激活的Risc,ATP依赖,RNase（内切酶、外切酶）切割目标mRNA,3OH,5p,Risc,反义链,降 解,5. RdRp（RNA dependent RNA polymerase）,RNA依赖的RNA聚合酶,放大效应：微量siRNA，明显干扰效应,可能机制： siRNA 重复利用, 目的mRNA直接扩增,RdRp,Risc,反义链,激活的Risc,5,3,Dicer,secondary siRNA,primary siRNA,mechanism of RNAi,脱靶效应（off-target）, 正义链干扰 正义链修饰, 反义链seed-region活性反义链修饰, 剂量依赖 cocktail smart pool,Risc,Risc,ATP依赖,（+）,（-）,（+）,（-）,Risc,（-）,mRNA,Risc,（+）,on-target,off-target,正义链干扰,目标mRNA,非目标mRNA,反义链seed-region活性,（+）,（-）,5,5,3,3,seed region 27 核苷酸,（-）,Risc,mRNA,mRNA,mRNA,Risc,Risc,3,3,5,5,3,5,目标mRNA,非目标mRNA,五、RNA干扰研究的一般技术路线,1、目的基因的确定,2、siRNA序列的设计,3、获得siRNA产物,4、siRNA转移,5、RNA干扰效果检测,siRNA序列的设计：,一般设计原则,（1）从mRNA 的AUG起始密码子（避开5和3端的非翻译区）开始，寻找“AA” 二连序列，并记录其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。 GC含量在30%50%左右的siRNA为宜。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除可能的同源序列。 （3）选出合适的靶序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，找到最有效的siRNA序列。 （4）设置合理的阴性对照：scramble siRNA 与siRNA组成相同，但序列不同。,获得siRNA产物,（1）化学合成已知有效的siRNA。,（2）体外转录筛选siRNA。,（3）Dicer（RNase III）降解dsRNA快速经济地研究某个基因功能。,2001000nt,体外转录,dsRNA,目的基因,Dicer,siRNA mixture,（4）siRNA表达载体,（5）siRNA表达框架,siRNA转移,（1）脂质体介导的转染,（2）病毒介导的感染,（3）电穿孔,RNA干扰效果检测,（1）mRNA：RT-PCR、定量PCR、Northern 。 （2）蛋白质：Western、ELISA、免疫荧光 （3）生理生化表型参数：,六、微小RNA（microRNA，miRNA）,1、miRNA：广泛存在于真核细胞中的一组短小的、 不编码蛋白质的RNA家族，由约22nt组成的单链RNA。,2、miRNA的发现：,The C. elegans heteroch ronic gene lin24 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14,1993年，Lee et al，Cell,线虫，lin-4 lin-14,2000年，Reinhart et al，Nature 线虫，let-7,The 21nucleo tide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans,拟南芥，水稻,斑马鱼，果蝇,鼠，人,3、miRNA的成熟：, 长的内源性转录本（pri-miRNA）, 70nt 茎环结构miRNA前体（pre-miRNA）, miRNA双链, miRNA单链- Risc复合物,miRNA duplex,Risc,（+）,（-）,Risc,（+）,（-）,目标mRNA,3,5,4、miRNA与目标mRNA的作用模式：, 3UTR 不完全互补，抑制翻译。, 编码区完全互补，降解mRNA。（类似siRNA与目标mRNA的结合与降解）, 上述两种模式均具备。,5,5、miRNA的生理功能：,时空性表达（组织特异性和阶段特异性） 控制个体发育,3,lin-4：第一、二期,let-7：第三、四期和成虫期,miRNA 产生： 基因组（正常） 来源： 内源转录本 直接来源： 发夹状pre-miRNA 结构： 单链 互补性： 不完全互补或完全互补 特异性： 相对较低 作用部位： 3UTR 或编码区 对基因的影响： 抑制翻译或降解目标 mRNA 生理功能： 调节内源基因的表达 控制个体发育,siRNA 病毒感染、转座子移位、导入dsRNA（异常） 病毒RNA或转基因（外源） 长链dsRNA 单链 完全互补 较高 编码区或UTR 降解目标 mRNA 抵抗病毒感染、抑制转座子活性,miRNA与siRNA的比较：,