农药生物测定20140224(2014314111621).ppt

第一章 杀虫剂的室内生物测定,张永强 西南大学植物保护学院,主要内容,基本概念,影响因素,设计原则,（1） 杀虫剂室内生物测定,1.1.1 一些基本概念,在实验室条件下，以昆虫（包括螨类）对杀虫剂的反应来鉴别某一种农药或某一类化合物的生物活性测定的一种基本方法。,（2 ）杀虫剂生物测定存在的问题 评判标准单一 人为地固定检查时间 无统一的标准试虫 一般用校正死亡率表示,核心是没有系统评判生物测定结果的方法和标准。,主要内容,基本概念,影响因素,设计原则,1.1.2.1 杀虫剂及溶剂 杀虫剂 其理化性质是决定毒力的根本原因。 溶剂 对药剂本身的理化性质一般不产生影响，但不同溶剂会影响昆虫表皮。,1.1.2 影响杀虫剂毒力测定的主要因素分析,1.1.2.2环境条件对测定效果的影响 （1）温度,影响到处理前-养虫,影响到处理过程中- 挥发、吸收等,影响到处理后- 昆虫的死亡率,（2）湿度 湿度一般不影响杀虫剂的穿透性及作用速度，也不影响解毒过程，通常它只影响昆虫对杀虫剂的忍受力; （3）光照条件及其他条件 光照条件以及昆虫在药剂处理前后的食物供应，营养条件等也会影响到测定结果。,1.1.2.3供试昆虫,影响试验结果,（1）卵与卵期,（2）幼虫（或若虫）期,（3）蛹期,（4）成虫,（5）昆虫的性别与生殖对杀虫剂的敏感性,一般雌性昆虫对杀虫剂的敏感性比雄性昆虫低。,但对有机磷杀虫剂来讲，则雌性个体比 雄性个体感受性低。,一些研究还表明，雌成虫在产卵前的敏感性低， 而产卵后则敏感性高。,1.1.2.4 药剂、环境条件和供试昆虫三者之间的关系,1.1.2.5 药剂处理与操作技术的影响,人为操作对实验结果的影响,主要内容,基本概念,影响因素,设计原则,1.1.3.1要控制影响因素,3 室内生物测定试验设计的基本原则,1.1.3 杀虫剂室内生物测定设计原则,1.1.3.2必须设立对照,设立对照的目的是为了消除自然因素而导致的试虫死亡。 试验时，要根据测定的需要，选择合适的对照。 但一般情况下，如果选择标准药剂对照，则还需要选择溶剂对照和空白对照补充。,1.1.3.3 必须设置重复,（1）标准目标昆虫,1.1.3.4供试的目标昆虫,要注意 的问题,标准目标昆虫是用来做药剂筛选和毒力指示用的。目标昆虫，则是用来测定某种药剂对其作用效果的昆虫。,（2） 供试的主要目标昆虫,（3）移取试虫的方法,第二节 杀虫剂室内生物测定结果的统计分析,1.目标昆虫对药剂处理的反应,2019/4/4,24,2.毒力的表达,2019/4/4,25,2.1毒力的表达 反应率：包括所有出现症状的反应情况（前面介绍的几种情况） 一般都是用死亡率表示； 2.1.1一般死亡率。 死亡率%=死虫数/试虫数100% 死亡率从广义上应理解为虫口减退率。死亡率可以是正的，也可以是负的，比如处理后的虫口可以是增加的。,2019/4/4,26,2.1.2 校正死亡率 校正死亡率的计算可采用生存率，也可采用死亡率，分别如下： 校正死亡率= ；（1） 校正死亡率= （2）,2019/4/4,27,2.2 致死中量ld50或致死中浓度lc50等 2.2.1致死中量（median lethal dose ） 2.2.2致死中浓度（median lethal concentration） 2.2.3 致死中时（lt50）或击倒中时（kt50）,2019/4/4,28,2.3 为什么要采用致死中数来表达毒力的大小?,2019/4/4,29,抵抗性中间的,3 如何求ld50 3.1 剂量-死亡率曲线转换成回归直线的必要性 由于剂量-死亡率曲线是一条不对称的s曲线，因此给以后求ld50带来困难，必须首先把它变成真正对称的s 曲线，转变的方法是将剂量用对数表示。 为什么把剂量改为对数表示就能将不对称的s曲线转变成对称s曲线呢？ 从生理学来讲，一般认为效应增加并不与剂量的增加成正比例，而是与剂量增加的比例成比例，也就是说，剂量是以几何级数增加的，而效应则是以算术级数增加的，因此，将剂量用对数值表示就可将之化为对称的s曲线。,2019/4/4,30,3.2转换成对称的s 曲线仍不能很好地求ld50 这是因为： 一是：一般试验是用5-7个梯度剂量来处理昆虫，而靠5-7个剂量死亡率的点来确定s曲线是困难的； 二是：s曲线的特点是两端平缓，中间一段很陡，因此，在死亡率靠近50%时，剂量对数值只要很小的变化，死亡率就会有很大变化，当死亡率为45-55%处的剂量与ld50 十分接近，因此难以准确地求出ld50 。 因此，我们必须设法把s曲线转换成一条直线，其办法就是将死亡率转换成机率值。,2019/4/4,31,1947年英国学者d.j finney的probit analysis一书问世，奠定了生物测定数据分析的基础。该书再版印刷多次，影响深远，被誉为生物测定的“圣经”。 死亡率或反应率本身是一个正态分布曲线。正态分布的情况可以用正态等差来表示： 正态等差=（变量（x）-均数（ x ）/标准差（s） 通过正态等差的转换，死亡率对应的正态等差的范围在-4与4之间。,2019/4/4,32,50%,0,0.14%,-3,3,-4,4,99.86%,3.3机率值分析原理,当变量小于均数时，正态等差为负数，当变量大于均数时，正态等差为正数；如果将正态等差均加上5，则变为19；而这19的任意数字足以表达死亡率的值。常用的机率值就是将正态曲线面积由左至右累加计算的；当机率值增加时，累加面积逐渐增大，当机率值为5时，累加面积为50%，当机率值为9时，累加面积为100%； 因此，所谓机率值，就是机率的单位（1-9），计算就是对正态分布曲线在横坐标上某一点的正态等差加上5 死亡率为0.01% 机率值为1.09098； 50% 5 ； 99.99% 8.7190； （实际转换时可查机率值转换表）。,2019/4/4,33,机率值分析的原理就是将正态的频率分布改为s累积曲线；再将累积曲线通过机率值转变成一条直线，然后求得这条直线的回归式。 在50%处（即机率值5处）引出一条横轴的平行线，与这一直线相交，交点处对应的剂量值就是ld50。这一方法的特点，就是对频率分布两端的值不予重视，而着重于分布的中间部分。,2019/4/4,34,2019/4/4,35,2019/4/4,36,3.4回归线及其坡度,2019/4/4,37,3.5求ld50 和lc50的方法,用点滴法测定辛硫磷对5龄玉米螟幼虫的毒力，试虫平均体重为0.046g/头，每头试虫点滴0.8l药剂丙酮液，48小时检查试虫死亡率，结果如表1示：,2019/4/4,38,表1 点滴法测定辛硫磷对玉米螟5龄幼虫的毒力,以剂量对数为横坐标，校正死亡率机率值为纵坐标，在坐标中相应的位置上标出各点，用目测法作一条平分各点的直线，此线即为毒力直线。自机率值5处引出一条平行于横轴的直线，在与毒力直线的交点处引出一条平衡于纵轴的直线，与横轴的相交处为ld50的对数值。根据表1可知ld50的对数值为1.085，其反对数为12.1619，即辛硫磷对玉米螟5龄幼虫的ld50值为12.1619g（药量）/g虫体重。 同样用该直线可求出毒力回归式y=a+bx。,2019/4/4,39,3.5.1作图法,1,2,x1,x2,y1,y2,卡方检验 这条ld-p线是主观目测决定的，是否符合实际，尚不清楚，应经卡方（2）适合性检测。 将各剂量的对数值（x）代入求得回归方程式y=a+bx, 求得相应的机率值y(理论值)。 根据求得的理论值，从死亡率-机率值表中查出理论死亡率p。 求各剂量的理论死亡数np(供试虫数与理论死亡率的乘积)。 求各剂量的实际死亡数r与理论死亡数的差，r-np。 求 ，即卡方值（2）。 将以上计算结果填入下表。如果所得的卡方值小于理论卡方值，则说明目测的ld-p线，符合实际情况。,2019/4/4,40,2019/4/4,41,卡方检验计算流程表,2019/4/4,42,按下列公式求回归方程y=a+bx中的a和b。即可得回归方程和ld50值。 b=nxy-xy/nx2-(x)2 a=x2y-xxy/nx2-(x)2 注意上面两个公式中的n不是供试昆虫数，而是处理剂量数。 卡方检验 同作图法。,3.5.2 最小二乘法,2019/4/4,43,计算校正死亡率值y校正理论死亡率值的定义为 y=理论机率值， p=校正死亡率， y=校正死亡率对应的机率值 z=相应的纵坐标 y=校正机率值,校正机率值法,作图法比较简单。如果利用对数一机率值纸，则可不必查对数表及死亡率(百分率)转机率值表而将各坐标点直接绘在这种纸上，方便、快速。作图法的缺点是不够精确，尤其是各坐标点比较离散时，很难目测画出一条合适的回归线。 最小二乘法是目前国内外广泛采用的方法，特点是比较准确。过去采用笔算或珠算计算比较麻烦，现广泛采用电子计算器或微电脑，计算已不成问题。 校正机率值分析法实际上仍属于最小二乘法。最小二乘法中，由于ld-p线是由常态曲线转化而来的一近似直线，不完全同于一般的回归直线，从ld-p线上读出的理论机率值与实际测得的机率值往往不符合，因此按照理论机率值求得的ld50并不完全符合实际情况，特别是当试验数据中，死亡率有小于16%或大于84%时这种差异更大，而应用校正机率值进行分析可获得更准确的结果。但这种方法的计算更加麻烦和费时。 一般情况下，如试验数据比较准确，结果近似直线的，则不必采用校正机率值法。,2019/4/4,44,2019/4/4,45,（只要有回归功能的计算器均可使用）。 可按下计算器mode 2键，使其处于lr状态下，将毒力测定中得到的x, y各组数据依次输入，即可得到毒力回归式、ld50及相关系数r。操作过程如下： inv在有的计算器中为shift键。,3.5.3 函数计算器输入法,2019/4/4,46,主要有sas（国际通用），dps（冯明光），irm（吴仕源）等 excel下运算，参考曹晓宇等，2000年，浙江化工（增刊，126-128）；马桢红等，1999，医学动物防制，15（11）：612-614。,2019/4/4,47,3.5.4电子计算机输入法,2019/4/4,48,大致的使用方法介绍如下： 1 打开irm的文件夹，双击“小蜜蜂”，即可打开。 2在“库文件”中可以选择打开库，可以看到一些现成的例子，如要自己计算就要选择“创建库”，自己命名一个文件名即可。创建后保存，就会在原来的界面的基础上加上“数据编辑” 3点击数据编辑就出现,irm软件使用,这个就是主要的工作界面了，一般情况下如果只做一两次的数据统计，基本数据就不需要填写，但是如果是要做一系列的试验，最好是把这些基本数据认真填上，为以后使用做好基础。在这里要把剂量单位选择好。,2019/4/4,49,2019/4/4,50,要统计的数据部分要在“实验数据”里进行统计，界面如下：,3.6致死中量的标准误差及置信限,3.6.1致死中量的标准误差sm 在统计学上，均数的标准差为/ ，其中是这个分布的标准值，n为观察次数，但致死中量本身是中数而不是均数，因此各观察值（死亡率-机率值）应按它们离中数的远近给予不同权重，越接近中数的值权重越大，这就是权重系数。于是致死中量的标准误差公式为,2019/4/4,51,因=1/b，即是坡度的倒数 所以， 式中nw的计算是把各剂量对应的机率值的权重系数由表中查出，各自乘以供试昆虫数，再将各个乘积相加。 以上求致死中量标准误差的方法比较粗放，精确的方法，如下式 x为各剂量的对数值，x为各剂量对数值的平均值，m为致死中量的对数值。,2019/4/4,52,3.6.2 致死中量 95%的置信限 致死中量的置信限即致死中量的可靠范围，亦即供试昆虫种群致死中量真值的波动范围。 当p=0.05，自由度为n（供试昆虫数），查t分布表得t值，则致死中量得置信限=ld50+tsm,因供试昆虫数一般大于50，可认为自由度为+，t值 为1.96。故致死中量真值的波动范围是： ld501.96 sm。 式中ld50和sm均为对数值，需查反对数，才是剂量的数值。,2019/4/4,53,在毒力测定中需要表达的结果： (1)求各剂量的对数值; (2)求各剂量的死亡率所对应的机率值 (3)按一定方法求出回归方程y=a+bx (4)求ld50，坡度b值，相关系数r (5)对回归方程进行卡方检验 (6)求ld50的标准误和95%的置信限。,2019/4/4,54,2019/4/4,55,第三节 杀虫剂室内生物测定的主要方法,1.杀虫剂毒杀作用的方式 根据杀虫剂进入虫体的部位及途径的不同,杀虫剂毒杀作用的方式可分为,内吸杀虫作用：凡是可以通过植物根茎叶以及种子等部位渗入植物内部组织， 随着植物体液传导植株，不妨碍植物的生长发育，而对害虫具有很高毒效的 化学物质，称为内吸杀虫剂。昆虫由于受内吸杀虫剂的毒杀作用而致死亡的 过程，称之为内吸杀虫作用。,2019/4/4,56,2. 胃毒作用的测定技术 基本原理：是使杀虫剂随食物一起被目标昆虫吞食进入消化道而发生毒杀作用，因此要尽量避免药剂与昆虫体壁接触而产生其它毒杀作用。 目标昆虫可以吞食含有药剂的固体食物或药液，根据目标昆虫取食量的差异又可分为,无限取食法,定量取食法,2019/4/4,57,即目标昆虫可以无限制地取食混有杀虫剂的饲料，不计算目标昆虫实际吞食的药量。此法比较简单，但不能避免其它毒杀作用的影响。 （实际上也常有触杀作用）。,2.1无限取食法,2019/4/4,58,其主要方法有： 2.1.1饲料混药喂虫法 固体药剂可以直接混入饲料中，液体药剂则需要挥发性较好的溶剂将药剂溶解以便能混合均匀（仓库害虫，直翅目昆虫等）以浓度为单位。 2.1.2培养基混药法 主要是指取食培养基的昆虫（双翅目的果蝇和鳞翅目的钻蛀性害虫）,饲料混药喂虫法,培养基混药法,土壤混药法,2019/4/4,59,2.1.3土壤混药法 即将定量的块状药剂（或毒料）与已过筛的潮湿沙壤土混合均匀，然后装在花盆里，在里面播种作物，并接目标昆虫，最后检查昆虫死亡情况，或幼苗被害情况。 （适用于金针虫、蛴螬、蝼蛄等地下害虫，可以反映出对昆虫的毒杀作用以及对植物的保护作用）,2019/4/4,60,基本原理是使供试目标昆虫按预定杀虫剂的剂量取食，或在供试目标昆虫取食后能准确地测定其含量。主要方法有（经典的）： 2.2.1 叶片夹毒法（sandwich method） 适用于植食性，取食量大的咀嚼式目标昆虫（粘虫、蝗虫、玉米螟、菜青虫等）。,2.2定量取食法,2019/4/4,61,基本原理是用两张叶片，中间均匀地放入一定量的杀虫剂饲喂目标昆虫，然后由吞食的叶片面积，计算出吞服的药量（常常限定一定时间内）。 其特点是：避免发生触杀作用、操作方便、结果比较精确。叶片上的药量是由喷粉或喷雾落在上面的量测算的，也可以在一定的叶面上点滴丙酮溶剂制成的药液。,2019/4/4,62,其具体操作步骤： 制夹毒叶片（直径0.4-0.8cm） 将待测目标昆虫称重编号（饥饿3-12小时） 接入培养皿中饲喂（一般是让昆虫将叶片取食完，取食的培养条件一定要进行保湿） 试虫重新饲喂培养（48小时后检查结果） 根据生死反应计算ld50或lc50。（每一个昆虫都记录，根据单位体重排序后且分为三组。）,2019/4/4,63,中间组即为第二组： a=中间组死亡虫单位体重吞食药量总和/中间组死亡虫总数 b=中间组活虫单位体重吞食药量总和/中间组活虫总数 ld50=(a+b)/2 吞食药量（g/g）=吞食面积mm2 每mm2药量（g)/昆虫体重（g/头） 或吞食药量（g/g）=药液浓度（g/ml）滴加量l10-3 )/昆虫体重（g/头）,2019/4/4,64,2.2.2改进夹毒叶片法： 是把药液的浓度数量增加，用微量注射器注射或点滴到叶片上，仅把圆叶片取食完毕的试虫作有效试虫，因此，每次测定时应增加试虫数量。致死中量的计算方法同上。 另外胃毒作用的测定还有液滴饲喂法和口腔注射法等，但都比较麻烦，不常采用。 重要的，而且非常实用的方法是改进夹毒叶片法，效果很好 另外还有离体叶片法，24孔板法等,2019/4/4,65,3.杀虫剂触杀作用的毒力测定 触杀作用主要强调药液直接作用于昆虫的体壁而产生毒杀作用的方法，要注意尽量避免药剂从口器或气孔进入虫体。 主要测定方法 直接施药法- 局部施药法-,2019/4/4,66,3.1喷粉、喷雾方法 接近实际，最常用，但是却需要精致的喷雾或喷粉装置。实际虫体接受的量不易掌握，只计算在一定喷雾量的情况下，供试昆虫的死亡情况。 方法是：将盛有目标昆虫的喷射盒或喷射笼或垫有湿滤纸的培养皿底，置于液体喷布器低部，或喷粉罩底盘上，定量的药液或粉剂均匀地直接喷洒在目标昆虫体上，待药液较干或者虫体粘的药粉较稳定后，将喷过药的目标昆虫移入干净的容器或培养皿内，置于适合目标昆虫生活的环境条件中恢复，1-2h后，放入无药的新鲜饲料后，于规定的时间内（24、48h）观察目标昆虫的中毒及死亡情况。,2019/4/4,67,3.2浸渍（zi）法以及浸玻片法 浸渍（zi）法是直接浸虫（放在一定容器中、或者叶片上） 浸玻片法：杀螨剂或者一些小昆虫的测定方法,2019/4/4,68,3.3微量点滴法 特点：（可以精确地计算出每头试虫或每克体重的用药量）。方法比较精确，试验误差小可以避免胃毒作用的干扰。 但是，试虫本身的生理状态和试虫的数量会影响测定的结果. 3.3.1微量点滴器的种类（适用于个体大的昆虫）： 千分尺微量点滴器 电动（手动）微量点滴器 毛细管微量点滴器 毛细管可以根据虹吸现象自动吸取药液，然后用口轻吸。 改进的即用橡皮头代替口吹。 微量进样器等（0.5-0.15l）（0.02-0.04 l ）,2019/4/4,69,3.3.2微量点滴法的测定技术 3.3.2.1对溶剂的要求，溶剂应具挥发性强和对药剂溶解度高的无毒物，常用丙酮加入5%的蒸馏水，以阻止溶剂很快挥发；加入0.1%的苏丹红作为液滴显色指示剂。 3.3.2.2溶液配制： 首先用溶剂（精确取量）先配成高浓度的贮备液（容量瓶稀释）。 根据实验要求按倍数关系，比例关系或等差关系，用溶剂将之稀释，由高向低依次稀释成系列浓度。 由于稀释浓度较低，加之操作中瓶口需要经常打开，浓度易变化，应随配随用，不易常时间保存。,2019/4/4,70,3.3.2.4点滴方法： 先将试虫稳定，然后快速点滴 ，吸取药液-不要让玻璃管或橡胶管进入药液中， 轻轻点滴，刚好接触，不要接触后再点滴，不要用力太猛，不要不接触就点滴。 对于活动性强的昆虫，可先冷冻或用co2麻醉后再点滴处理。 先点滴对照，然后由低到高，依次处理。 3.3.2.5注意控制正常的环境条件 3.3.2.6点滴处理后保持时间：大多为48小时，少数为24小时或72小时，一般以正常条件下没有生理反应为死亡。,2019/4/4,71,3.4药膜接触法：（局部主要是足部） 对强大接触毒性的农药以及爬行昆虫，可以用这种方法测定，特别是用储粮保护及测定仓库害虫毒力时，主要采用药膜法。 基本原理是将一定量的杀虫药剂，采用浸沾，点滴或喷洒等方法施与物体表面上，形成一个均匀的药膜，然后放入一定量的供试目标昆虫，让其爬行接触一定时间后，再移置正常的环境条件下，于规定时间内观察试虫的中毒死亡反应，计算击倒率或死亡率。 药膜法的关键是形成均匀一致的药膜。,2019/4/4,72,药膜形成的方法： a喷雾法， b喷粉法， c涂抹法， d用挥发性溶剂处理表面法（影响试验结果主要是药膜形成的方法） e浸滤纸片法：用丙酮、石油醚及白油（或缝纫机油）1：3：1混合获得溶剂，然后配制不同浓度梯度。滤纸9cm 放在培养皿上，滴加1ml配制好的溶液，然后放在9cm培养皿中，让试虫在上面爬行。计算kd50（一定时间内以剂量表示）,kt50（用时间对数来求（一定浓度用时间表示） f 玻璃管内壁成膜法 加入一定体积一定浓度的药液形成均匀药膜，应长一点。 重点是计算出单位面积药量（一定处理时间lc50或ld50来表示） g 蜡纸粉膜法,2019/4/4,73,4杀虫剂熏蒸作用的毒力测定,目的：一是为筛选有熏蒸作用的杀虫剂提供依据；二是为进一步研究杀虫剂熏蒸作用的机理作准备；三是测定不同熏蒸剂对不同种类昆虫的熏熏蒸致死毒力。,fumigation action,2019/4/4,74,杀虫剂熏蒸作用生物测定的主要方法：,2019/4/4,75,5保幼激素及其类似物的活性测定 点滴法:蛹期-成虫期转变（化蛹后4-8小时的蛹供试） 化蛹前很难判断，一般严格龄期 一般也不用低龄幼虫来做试验（很难准确判断） 如果是幼虫，应准确控制龄期。 另外也可采用饲料混毒的方法进行测定。,2019/4/4,76,根部内吸（纵向传导） 植株的主根顶端切除插入盛有药液的小玻璃瓶内，其他的侧根置于营养液中培养。 叶内吸（横向传导） 部分叶片全面施药，叶片局部施药和叶柄施药。 茎部内吸 用毛笔将药剂定量涂抹到茎部的一定部位，并限定长度和面积。经一定时间在叶片上接虫或摘取叶片饲喂幼虫。 种子内吸法 药剂浸种法（药液量是种子量的两倍）或拌种法而使药剂附着在种子上，将之插入土中。随种子吸收水分而吸收药剂，待幼苗长出真叶后，在其上接虫或采回叶片饲喂昆虫，以测定药剂的内吸杀虫作用。,6内吸杀虫活性的测定,2019/4/4,77,7.拒食活性的生物测定 选择性取食试验和非选择性取食试验,没有加药,加有药剂,都加有药剂,选择性拒食试验,非选择性拒食试验,2019/4/4,78,8.微生物杀虫剂的生物测定 关键是创造一个杀虫剂与供试生物接触的平台。如真菌类杀虫剂对蚜虫的毒力测定。 采用“孢子浴”(spore shower)方法,对若蚜进行接种。 （1）将产孢盛期的菌丝琼脂平板倒置于载有若蚜的包心菜叶(平放于150mm大培养皿内)之上，使分生孢子自上而下地弹射降落到蚜虫体表，通过控制接种时间(0.2590min)而获得不同孢子剂量的处理。 为了尽可能接种均匀，每处理间隔14时间将菌丝琼脂平板旋转90 同时在叶片中央置一盖玻片收集孢子而后在显微镜下通过9点取样观察确定每处理的实际孢子剂量,2019/4/4,79,（2）接种完毕后，挑去叶片反面不太可能沾染孢子的蚜虫，用经针尖穿孔的保鲜膜密封以确保皿内相对湿度近于饱合而又不形成水滴。 包心菜叶柄基部用浸渍十字花科蔬菜营养液的棉球包住。外面再包上保鲜膜以防液体流失，每天观察时补充营养液如此处理的包心菜叶可以维持10d而无需实验中途更换菜叶。 （3）然后将不同剂量处理的蚜虫在温光培养箱(20，12l：12d)培养，逐日观察。取出蚜尸培养24h后镜检确证死因。每处理若蚜不少于90 头 （4）根据孢子量对应的死亡率来确定孢子对蚜虫的致死效果。,2019/4/4,80,9.细胞生物测定方法简介 mtt方法是mosmann (1983)首创的一种鉴别统计细胞死或活的方法。 19891990年，美国学者stipanovic等首次将mtt方法引入昆虫细胞量的测定，并研究了棉酚系列天然产物对美洲菸夜蛾细胞(简称hv细胞)的毒力。 altman(1988)等比较系统地研究了4种有机溶剂对hv细胞的影响。 华中师大周春青等（1997）对mtt方法做了些改进，并研究了6种有机溶剂对中国棉铃虫细胞(简称ha细胞)生长的影响其生物测定方法是：,2019/4/4,81,1 每孔加ha细胞悬液100ul（浓度3 x105细胞ml）,空白对照,2 培养过夜后每列加不同浓度 100ul tc-199-mk稀释的药剂 (一共5个浓度）,tc-199-mk对照,3 27培养20h后，加20ulmtt母液（所有处理）,4 弃去上清液后，加200ul溶剂a （所有孔）,5 30min后 在750nm处比色,2019/4/4,82,置elisa仪，在570 nm处读取od值，读取值换算为存活率，换算公式如下。 存活率（）=（试样od值/空白对照od值）100% 每种溶剂重复4次，然后计算出每一浓度梯度的平均存活率,第二章 杀菌剂的生物测定,第一节 杀菌剂生物测定的基本概念 1. 杀菌剂室内生物测定的主要内容 1.1 定义 是将杀菌物质作用于细菌、真菌或其它病原物（包括线虫）,根据其作用效果的大小来判断药剂毒力；或将杀菌物质施于植物，通过对病害发生的有无或轻重的观察来比较判断药剂的效果。,1.2 杀菌剂的生物测定的三个测定系统,直接毒力测定 （病原菌-药剂）,病原菌-药剂 -寄主植物,药剂-寄主植物 -病原物-环境,1.3 杀菌剂生物测定技术研究的主要内容及应用范围,杀菌剂生物 测定的 主要内容,1.4 杀菌剂的作用机理 由于杀菌剂需要考虑病原物药剂植物三者的关系，因此其生测的内容相对复杂一些，但主要掌握了杀菌剂的作用原理，就可以有效的进行杀菌作用的筛选。,化学 治疗作用,化学 免疫作用,化学 保护作用,用药剂处理植物和植物的环境，在病菌侵入寄主植物之前，发挥药剂的作用，保护植物不受病菌侵染的措施。,在病原菌侵入植物之后使用杀菌剂消灭或控制病菌，使植物不再发病。,是指植物通过药剂的作用，使植物具有对病菌的抵抗能力，避免或减轻病菌的侵害。,第二节 杀菌剂的生物测定技术,1. 判断杀菌剂抗菌力的测定方法 即在供试菌直接接触药剂的情况下测定毒力的方法,药剂+培养基,抑制菌体增殖,阻碍菌丝生长,真菌孢子萌发的抑制力,杀菌剂生物测定方法,快速，当天测定，第二天即可获得结果 载玻片；病菌孢子悬浮液滴；保持一定时间，镜检孢子萌发率，判断药剂毒力,生长速率法,水平扩散法,pda；载毒培养基；菌落直径,牛津杯法 滤纸片法 孔碟法 滴下法 洋菜柱法,2 杀菌剂生物测定方法,抑菌圈不清晰的原因： 抑菌圈不圆或破裂，或呈馒头形，会有多种原因： (1)往小管中加药液时，药液不慎溅出，小管底部不平，加之培养基太硬，药液漏渗或在培养基上放浸药滤纸片时不平稳等； (2)供试菌种老化或污染了杂菌或浇制培养基时温度太高； (3)菌种不纯，如果是两个对药剂敏感性不同的菌种，则会出现双抑菌圈。 (4)当小管（或滤纸片）彼此间间隔太大而抑菌圈较大时则圈与圈之间彼此影响，造成馒头形抑菌圈。 (5)上层培养基厚薄不均，或供试菌加入培养基未混合均匀都会影响抑菌圈不成圆形； (6)培养基有杂质影响了药剂的扩散。,2 杀菌剂生物测定方法详述,2.1孢子萌发试验法 （历史最悠久，且应用最广泛的测定方法, 但主要是针对真菌孢子）。 2.1.1 其优点是：快速，当天测定，第二天即可获得结果。 2.1.2 可用于保护剂的测定,作用机理的研究,2.1.3主要原理：是将供试药剂以各种方法附着在载玻片上或其他适当平面上，然后将病菌孢子悬浮液滴在上面（或将药液与孢子悬浮液混合滴于载玻片上）。在一定环境条件下，保持一定时间，镜检孢子萌发率，判断药剂毒力。,2.1.4操作步骤（要严格按照微生物实验要求进行）： 洗净载玻片+0.25%火胶棉形成一层透明的薄膜均匀滴加一定体积（或数量）的孢子+药剂混合液保湿培养镜检孢子萌发的数量结果表示：校正抑制孢子萌发率（%）。,2.1.5注意事项： 2.1.5.1供试菌种的要求： （1）菌种纯。 （2）用培养基长期培养不易产生变异； （3）孢子体型大，萌发快，容易在显微镜下观察；在分类上具有一定代表性，又是重要病害的病原物。 另外，由于菌种敏感性的差异，对于一种药剂的试验，最少要用两个菌株来筛选。 主要的菌株有：（1）水稻胡麻叶斑病（最明显，效果最好）。（2）马铃薯黑星病菌。（3）小麦锈病。（4）麦类赤霉病。（5）马铃薯晚疫病等。,2.1.5.2供试孢子悬浮液的配制 首先怎样获得大量的孢子，大家可以参考教材。 第一、要能够获得大量的孢子。生殖生长与营养生长的条件不一样，可以采用下列措施获得孢子：改变培养基的成分；选用不同的培养基；改变培养基的酸度；改变培养基的湿度条件等等。 第二、注意孢子萌发时，悬浮液中孢子的浓度对萌发有很大的影响。因此，要控制单位体积内孢子的数目。一般规定孢子浓度最好是50000个/ml，在低倍镜下观察时，每个视野中约有35个孢子（接目镜10倍，接物镜10倍）。如果孢子较大，可适当降低浓度。 第三、孢子悬浮液的配制：一般是将已培养好的菌种（斜面培养或三角瓶培养）加入灭菌蒸馏水，用接种环在培养基表面轻轻摩擦，使孢子悬浮于灭菌水中。然后用双层纱布过滤，除去菌丝和培养基块。用显微镜检查计算孢子浓度，加水稀释到所要求的孢子悬浮液浓度。,2.1.5.3孢子萌发的条件及调查方法 温度、湿度、酸碱度、光照、氧气等条件。如果萌发条件合适或近似，则在最短时间内可获得最大萌发百分率。 判断孢子是否萌发，以孢子萌发后的芽管大于孢子短半径时计算，否则不算萌发。 有的病菌孢子中产生游动孢子，不宜在显微镜下观察其萌发情况，则以孢子囊是否产生游动孢子为标准。例如：马铃薯晚疫病菌孢子囊产生游动孢子后，孢子囊即为空壳，在低倍显微镜下很容易观察到。,2.1.5.4结果表示 (1) (2)以抑制孢子萌发50%时的药量为标准ed50。其计算方法和杀虫剂的相似。,2.2 含毒介质培养法 2.2.1 生长速率法 2.2.1.1原理 将不同浓度的药液与融化的培养基混合，制成带毒培养基平面，在平面上接种病原菌，以病菌生长速度的快慢，来判断药剂毒力的大小。 生长速率的表示方法： a.一定时间内菌落直径的大小。 b.菌落达到一定直径所需要的时间（抑菌时间）。 一般都用前者来表示。,2.2.1.2优缺点： 优点：一是操作比较简单；二是对杀菌剂的主要剂型（乳油、水剂、可湿性粉剂）都适用；三是重复性好，主要认真操作就可得到可靠结果。 缺点：对供试菌要求严格，必须具备以下条件：病菌要容易培养，菌丝生长速度快、整齐，产生孢子缓慢；是主要的农业植物病原菌。,2.2.1.3 操作步骤 （1）制备带毒培养基平面 将供试药液稀释成一系列浓度后，准确吸取一定量的药液加入到一定量的融化的培养基（冷却到50左右）中，混合均匀（必须在凝固前）倒入到灭菌的培养皿内，冷却后即成带毒的培养基平面。,混药的培养基,灭菌的培养皿,（2）接种病原菌。 a.菌饼接种法： 制备病菌孢子液与融化的培养基（50左右）混合均匀倒入到无菌培养皿内，凝固后用0.4cm打孔器打取带菌培养基饼。 然后用接种针或消毒镊子夹取菌饼反向放于带毒培养基平面上。每个培养皿可放3个菌饼，应注意菌饼间的距离要适当，以不影响菌落的生长为易。 另外也可以培养菌丝，待接有菌的培养基长到一定程度后，在菌丝上打一些菌饼来进行接种。,孢子或菌丝制成的菌饼,b. 画线接种法：用接种针沾取病菌孢子液在带菌培养基平面上划一直线进行接种。定温培养一定时间后，测量菌丝伸向直线垂直方向的长度。,接种线,(3)结果表示： 有了抑制生长率就可以根据浓度对数求出ed50. 附着法:（滤纸片附着法、种子附着法）可采用将真菌孢子附着在一定材料上，再放到加入药液的培养基中。基本原理都是采用生长速率法。,2.2.2水平扩散法（与生长速率法菌落和药剂是相反的） 2.2.2.1 原理 在已接种的洋菜蔗糖、马铃薯培养基（pda）（通常在培养皿或其它适当容器）表面，采用各种方法使药剂与培养基接触，定温培养一定时间后测定抑菌圈大小。 该法称水平扩散法或抑菌圈法、洋菜平面法等。,2.2.2.2 主要方法简介 根据试验时药剂施加于培养基表面的方法的不同可分为： （1）牛津杯法,1cm,内径6mm,外经8mm,a，制培养底面 在直径9cm培养基上倒入约20ml水洋菜培养基，凝固后作为底层，底层的目的是为了保证“上层”厚薄均匀。 b，形成菌面：然后将马铃薯蔗糖培养基融化，在5060接种供试菌（孢子浓度10x15倍每视野810个孢子），取少量（4ml）均匀倒入形成菌面。 c，放置牛津杯 试验平面上放4个不锈钢圆筒（外径8mm，内径6mm，高10mm） d，加药：加药液在管口形凸面约0.6ml。 e，培养适当温度下，培养一段时间后，取出。 f，测量抑菌圈的大小：用十字交叉法测量抑菌圈的直径。,（2）滤纸片法：滤纸片上定量滴加药液，凉干后放于带菌的培养基平面上。 （3）孔碟法：打孔洋菜。或事先在培养基内放置玻璃圆筒，倒入培养基，凝固后取出小圆筒，洋菜上即留有圆洞，药液加入其中。 （4）滴下法：直接滴加（注射器、毛细管、移液管等）。 （5）洋菜柱法：打带药的筒状洋菜样，置于培基平面上。,3 影响水平扩散法的主要因素 （1）对供试菌种的要求 一般情况是，菌种在培养基中容易培养，而且药剂处理后抑菌圈清楚均可采用。但是若以水平扩散法作定量测定时（特别是抗菌素效价测定时），必须是具备下列条件的菌种：,a 对被测定的药剂有一定的敏感性，生成的抑菌圈界限明显，便于测定。 b 容易培养，生长快，不易为杂菌污染，且不易发生变异。 c 容易作成接种菌液（菌丝体或孢子） d 菌种有较强的抗热性。 e 对人畜无毒害，在操作中无不良气味。 如：枯草杆菌（细菌）在测定抗菌素、汞制剂中广泛应用，效果很好。 这里的条件主要是指用来筛选药剂的.如果测定一种药剂对病原菌的效果,则病原菌不受限制.,（2）对培养基及培养条件的要求。 目的要让菌种良好生长，测定时有明显的抑菌圈。(菌种与培养基的对应性) （3）供试药剂配制和施药时剂量的稳定以及药剂的质量等都有影响，仍然要有精密的浓度换算。 药剂的浓度要与培养基混合后计算浓度，而不能仅用原来的浓度来表达。,(4)测试设备：滤纸片、牛津杯，其大小、尺寸、重量、材料等要严格要求。如滤纸片上加药： 水溶液0.09ml 直径是12.7mm的滤纸片 酒精0.08ml 丙酮0.07ml 滤纸片大小一定，浸药时间一定，放在滤纸上将多余的药吸取的时间也一定，就可保证有比较稳定的测定结果。,（5）接种培养基的厚薄，特别是接种培养基要尽量薄。一般直径9cm的培养基上最好是5ml。加入量过大，培养基平面加厚，抑菌圈有时形成圆锥形，边界不清楚，测量时易产生误差；量太少，则不易形成均匀的平面。尤其在室温较底时，培养基冷却凝固较快，更不易制成较均匀的平面，所以要进行精确的操作。(因此要有底面) （6）找出最佳抑菌时间。抑菌圈大小的变化与时间有如下相关性： 一般情况下，随时间的延长抑菌圈会增大,需要注意无抑菌圈产生的情况 例如硫酸铜和硝酸银浓度为1x10-3mol/l采用滤纸片法进行测定时，无抑菌圈产生，而硫酸锌仅有微弱的抑菌作用。这说明，滤纸片抑菌法不适用于无机化合物的毒力测定。主要是因为: (1) 滤纸片本身带的是负电荷而且洋菜解离后也会产生阴离子，这些会对带正电的有毒阳离子产生吸附作用。 (2)洋菜所具有的碱性及磷酸根也对阳离子毒物有形成氢氧化物和磷酸沉淀的作用。 这两种作用阻止有毒阳离子自滤纸片向周围培养基的扩散，故不表现出抑菌作用。,4水平扩散法的应用范围 (1) 农用抗菌素效价的测定。 所谓效价，就是衡量抗菌素有效成分和质量好坏的一个指标，既衡量抗菌素效能的指标。用标准品作对照进行测定。,衡量抗菌素效价的单位： a.牛津单位：规定一个牛津单位是： 在标准情况下，能在50ml肉汁培养基内完全抑制金黄色葡萄球菌（牛津标准菌种）生长时青霉素的最低含量。这种单位又叫稀释单位，即用稀释倍数来表达单位。在最初由于不能获得纯品，而且在加工、储存过程中，其有效成分又有遭到破坏的可能，所以以稀释单位作为效价单位用的比较广泛。 如：1mg青霉素，在一定条件下，稀释3600倍，尚能抑制金黄色葡萄球菌的繁殖，则1mg青霉素含有3600个单位。,b.重量单位（因为有了纯品，就可由重量来衡量） 1944年国际卫生组织规定：以纯净的卞青霉素钠盐的含量作为衡量抗菌素效能的标准，按重量标准1ug相当于一个单位。 c.国际单位仍为重量单位：即0.6ug卞青霉素钠盐相当于一个国际单位，而这个国际单位等同于一个牛津单位。 1mg卞青霉素钠盐相当于1667个国际单位 200万单位是多少?,(2)判断物质有无抗菌力。特别是滤纸片法，非常简单，快速有效，即将灭菌滤纸片（干热或酒精灭菌）置于实验平面上，上面加有极微量的物质即可。特别是以真菌孢子作为供试生物，具有的同时观察抑制孢子和菌丝发育两种作用的优点。 (3)植物体残留抗菌物质的测定。如课本上 讲的植物组织中链霉素的测定、甲基托布津的测定等。（生物层析法的测定） (4)药剂的变质和组分差异的测定。变质之后，化学成分不清楚时，采用生测的办法来判断其是否有效。,生物层析法简介 （1）生物层析法(薄层一生物法) 杀菌剂生物学的定性(或定量) 法是由水平扩散法和纸上层析法(或薄层层析法)组合而成的。一般称为生物一层析法。 与化学方法比较，精确度虽有所下降，但操作容易，不需要价格昂贵的装置，检出的敏感度有时比化学显色法还要高。分析中用极微量的试材就够了，而且直接以抗菌成分为对象，所以对药剂在植物体、土壤中等运行的判断，也是比较有效的方法。,(2)方法概述 滤纸可使用质量好的定性滤纸，大小为72cmx 30cm。 试验溶液的配制 供试药剂用水，丙酮，酒精等溶解。浓度可根据供试菌敏感度不同而异，大体上可配成1001 000ppm 样品的展开： 在离滤纸一端3cm处用铅笔划一起始线，约每间隔3cm滴一滴药液 (0.005一0.05m1)。这时溶液的扩散直径应在0.5cm之内。 药液干燥后，用夹子把滤纸上部和下部两边固定使成圆筒状，按普通纸层法操作，在备好的玻璃缸内(高30cm，直径15cm)，用上升法展开到15cm左右高度。,. . . . . . . . . . . .,15cm,检出法： 在印像用的搪瓷盘中注入15一2洋菜液100150ml，固化后制成水平床面，在上面铺叶清洁的玻璃板(16.5cmx12cm)。然后取融化的洋菜马铃薯培养基5060ml，在50左右时与10ml供试菌孢子悬浮液混合，均匀的加在玻璃板上制成试验平面。(三层底面) 将展开后已彻底除去展开溶媒的滤纸平铺在固化的试验平面上，当试验平面的水渗出滤纸约10min后，把滤纸取出弃去，然后在盘上盖上玻璃板(毛玻璃)，在供试菌发育的适温下培养至发现抑菌斑。供试菌若使用细菌、酵母，通常在28一30培养1520h后，将玻璃板连同试验平面取出，观察抑菌圈的位置、形状。,二 杀菌剂药效的室内测定方法 以寄主植物发病的程度来衡量药剂毒力的方式称为药效测定，这包括温室植株测定，大田药效试验和室内一些测定方法。 药剂与植物部分器官如叶、果、种子等相互结合的一个测定系统。 2.1 叶片接种法与叶碟漂浮法 叶片接种法比较简易，能在室内进行，比孢子萌发法和含毒介质法接近生产实际，可看作是盆栽实验的过度阶段。 叶片接种法是通过叶面来创造一个培养平台，上面有药剂，再接病原菌。 其基本原理是将容易感染供试菌的植物叶片（如蚕豆叶片）经不同浓度的药剂处理后平放在培养皿内，再将一块培养好的供试菌菌丝体（如纹枯病菌）这里也可以接种病原菌的孢子放在叶片上，经保湿培养一定时间，检查其病斑面积，并以此来衡量供试药剂的毒力。,叶碟漂浮法：其原理是将容易感染供试菌的植物叶片（如黄瓜叶片）制成直径1.5cm叶碟，漂浮在不同浓度的药液中，将供试菌（如黄瓜霜霉病菌）孢子悬浮液定量滴加在叶碟上，在光照下培养一定时间，调查病斑面积。,三 杀菌剂温室植物盆栽实验法 3.1定义：利用药剂、病原菌和温室植物三个系统来判断杀菌剂对植物上病原菌的控制效果和植物的保护作用的测定方法，即为杀菌剂温室植株测定法。 3.2优点：利用盆、钵培育幼嫩植物进行生物测定，是研究杀菌剂的有效方法之一。 （1）盆栽试验法不受时间、地点的限制，在设备良好的条件下任何时候均可进行。 （2）盆栽实验克服了在离体条件下对病菌无效而在活体条件下有效的化合物的漏筛。 （3）盆栽试验法更接近于大田实际情况，所得资料对指导生产实际有较高的参考价值。 （4）盆栽试验法所用材料易得，条件易于控制，在当前的杀菌剂研究中，越来越重视盆栽试验法，有些公司在进行活性筛选时甚至只用盆栽试验法，而淘汰了离体试验法。,3.3盆栽实验的供试植物 供试植物应容易栽培而且生长迅速，应是国内主要农作物（如水稻，小麦、黄瓜、棉花，蕃茄等等），对病菌应是高度高度感病，对一般杀菌剂不过度敏感。 植物发病是盆栽试验法的基础。作物品种之间感病性差异很大，而且同一品种的不同生育阶段感病性不同，如棉花，幼苗期比成株期易感病，但黄瓜(霜霉病)却是成株期比苗期更易感病。因此，应选感病品种的最易感病的生育期供盆栽试验。此外，植株的生长状态，阳光、水肥的供应都对感病有直接影响。对许多植物病害来说，多施氮肥，造成植株嫩绿，叶片肥厚，就容易感病。,3.4供试病菌 首先要求供试菌容易培养（最好在培养基中能够培养），易产生大量孢子，还应该是国内主要农作物上的病原菌。 供试病菌基本上是由供试植物决定了的。如供试植物是水稻，就用水稻主要病害(如水稻稻瘟病，水稻纹枯病)的病原菌。,供试菌种的致病力也是盆栽试验成功与失败的主要因素。病原菌的致病力不是固定不变的性状。在同一病原菌中，有致病力强弱不同的菌系和小种。病原菌的致病性与其生理、生化及其他生物学特性有密切关系，在适应新的环境的同时，病原菌可以改变其致病性。 如用高粱粒培养的水稻稻瘟病菌孢子和采自田间的感病稻茎节经保湿后产生的孢子，其致病力相差较大，一般情况下，后者的致病力较强。即使同是人工培养基产生的孢子，因培养基配方不同，培养条件不同，其孢子的致病能力也不同，这些都应加以注意。,3.5接菌方法 病害的传播方式不同，接菌方式也不同，必须首先了解要接种的病原菌的主要传播方式和侵染途径。 气流及雨水传播的病害可用喷雾法或喷粉法接菌。 如病菌主要由气孔侵入，接菌时应注意在叶背面接菌。喷雾法接菌一般是将孢子悬浮液喷在植物表面，为了使孢子在悬浮液中均匀分散，可适当加入湿润剂，这不但有利于孢子分散，而且也有利于悬浮液在植株上附着。如果孢子在悬浮液中分散不匀，植株发病后有些叶片可能病斑连成一片，有些叶片则没有或很少有病斑，给病情调查带来困难和误差，孢子悬浮液中孢子的密度以及是否加入粘着剂对发病影响很大。以稻瘟病菌的接菌为例，稻瘟病菌孢子以在低倍镜下(10x15)每视野100个孢子为宜，在孢子悬浮液中加入0.25的明胶作粘着剂也会收到良好效果。,接种锈菌和白粉菌时，可先在小麦植株上喷水，以造成在叶片上有水膜，然后用滑石粉将孢子粉稀释，采用喷粉装置接菌。 水