梅毒的实验室诊断.ppt

梅毒的实验室诊断,珠海市慢性病治站 刘小凤,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒的实验室诊断,梅毒（syphilis）是由苍白螺旋体 （treponema pallidum tp）感染引起的一种慢性性传播疾病，本病表现复杂、病期长，几乎可侵犯全身各个器官，发展过程时隐时现，症状和体征呈多样化，自然感染过程（不治疗）可产生不同临床症状的一期、二期、三期梅毒。,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体,梅毒螺旋体特点 1.小而细螺旋状，长614um,直径0.250.3um.有814规则、紧密螺旋。 2.透明不容易着色. 3.微需氧（13）,人工培养不生长。 4.繁殖方式为裂殖. 5. 对热敏感，骤冷超低温保存数年，复活后接种动物其毒性、活力、形态不变。,2011.8.31,www.zhccdc.com,致病机理,梅毒螺旋体破损皮肤及粘膜感染 24周潜伏感染局部螺旋体大量繁殖硬下疳 经38周 症状自行消失 tp附近淋巴结 血液播散 全身组织和器官 二期梅毒 三期梅毒 心血管、神经等损害。,2011.8.31,www.zhccdc.com,传播途径,性传播：性接触 是主要的传染途径 未经治疗的患者在感染后的1年内最具有传染性。 随着病期的延长，传染性越来越小。 到感染后4年，通过性接触一般无传染性。,2011.8.31,www.zhccdc.com,传播途径,垂直传播：胎传 在妊娠任何阶段，梅毒螺旋体均可通过胎盘传染。 病期越长，传染性越小。 早期梅毒的母亲，发生流产、死产、胎儿先天梅毒或新生儿死亡率高于晚期梅毒的母亲。,2011.8.31,www.zhccdc.com,传播途径,间接传播： 污染物、输血。,2011.8.31,www.zhccdc.com,各期梅毒标本采集及检查方法,临床症状 取材部位 检查方法 一期梅毒 硬下疳、淋巴结 暗视野检查 血液 血清学检查 二期梅毒 皮损、淋巴结 暗视野检查 血液 血清学检查 隐性梅毒 血液 血清学检查 三期梅毒 血液 血清学检查 神经梅毒 血液、脑脊液 血清学检查,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒实验室诊断方法,梅毒,病原体检查,血清学检查,暗视野检查法,镀银染色法,直接免疫荧光法,确证试验: fta-abs、tpha、 tppa、tp-elisa、 tp-rt 19s-igm,初筛试验：vdrl、usr rpr、trust,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒实验室诊断方法,病原体（梅毒螺旋体）检查： 一、暗视野检查 二、直接荧光抗体检查 三、涂片染色检查法：镀银染色、吉姆萨染色、墨汁负染色。,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,一、暗视野检查法 原理 一期梅毒硬下疳、肿大淋巴结的淋巴液。 二期梅毒皮肤粘膜损害、扁平疣、梅毒疹。 梅毒孕妇羊水(7周) 以上标本均有梅毒螺旋体存在，此时用暗视野显微镜检查能找到梅毒螺旋体。,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,检查方法 1、皮损取材：在载玻片加一滴生理盐水，用棉拭子蘸取无菌生理盐水抹去皮损（硬下疳、溃疡、梅毒疹、扁平疣）表面污物，挤压皮损周围，用钝刀刮取组织液混入载玻片盐水中，加盖玻片后暗视野镜检。 2、肿大淋巴结取材：酒精消毒淋巴结表面，用1ml无菌注射器配12号针头，吸取无菌生理盐水0.25-0.5ml,无菌操作穿刺淋巴结并注入盐水，再吸入注射器内，如此反复2-3次，取少量淋巴液于载玻片上，加盖玻片后暗视野镜检。,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,3、羊膜穿刺：梅毒孕妇的羊膜穿刺由专职人员操作，将取得的羊水直接滴于载玻片上加盖玻片暗视野镜检。,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,结果 暗视野镜检可观察到特征性的梅毒螺旋体。 螺旋整齐，数目固定（814）。 白色透明折光性强。 特征性运动方式：旋转运动、伸缩移行、弯曲前行。,2011.8.31,www.zhccdc.com,暗视野显微镜法直接镜检图像（1000）,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,临床意义 、暗视野检查可作为梅毒诊断的确证试验，若发现有梅毒螺旋体，即可确诊为梅毒感染。 、此法特别适用于血清学试验阴性的早期梅毒诊断，尤其对早期有硬下疳，但梅毒血清反应尚未呈阳性者意义更大。 3、暗视野检查是目前快速诊断先天性梅毒可靠的检查方法。,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,注意事项 1、取材前，要清洁皮损表面的污物。 2、应多取组织液提高阳性率，但要尽量避免出血。 3、取材后立即观察，以免影响活力 4、注意梅毒螺旋体的特征及运动方式，以鉴别其它螺旋体。 5、口腔中存在其他螺旋体，不推荐用于口腔皮损检查。,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,6、阴性结果不能排除梅毒，应稍后复查或做 血清学检查。 原因可能是： 螺旋体数量不足 已用过抗生素或某些外用药 损害接近自然消退,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,二.直接免疫荧光试验（dfa）,tp-ag （标本） tpmcab-fitc,37 x30分,tpag-ab-fitc,洗涤封片荧光镜检,莱果绿色梅毒螺旋体,2011.8.31,www.zhccdc.com,直接免疫荧光法镜检图像（1000）,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,方法学评价： dfa法特异性及敏感性均大于暗视野显微镜 检测。 可区分梅毒螺旋体与非致病性螺旋体，可适 用于口、肛周等部位的损害。 可因取材、荧光素、抗体质量及操作技术等 因素而致假阴性。,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,三.镀银染色法,标本涂片（tp）,自然干燥,固定、媒染,洗涤,银氨液染色,封片镜检,可见棕褐色梅毒螺旋体,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,观察有无染成棕褐色的梅毒螺旋体。 染色阳性，又有典型皮损可确诊。 染色阴性，不能完全排除梅毒。 某些腐生螺旋体可导致假阳性结果。,2011.8.31,www.zhccdc.com,病原体检查法,常见病原体检查方法比较,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒血清学试验,根据抗体的特性和反应性质梅毒血清学试验分为： 非梅毒螺旋体血清试验(初筛试验) 梅毒螺旋体血清试验(确证试验),2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒血清学试验-非梅毒螺旋体血清试验,抗原：心磷脂、卵磷脂、胆固醇混合物。 方法有： 性病研究实验室试验(vdrl) 加热血清反应素试验( usr) 不加热血清反应素环状卡片实验( rpr) 甲苯胺红不加热血清反应素试验(trust),2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒血清学试验-梅毒螺旋体抗原血清试验,抗原：梅毒螺旋体 目前常用方法有： 1.梅毒螺旋体血球凝集试验(tpha ) 2.梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(tppa ) 3.荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（fta-abs） 4.梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（tp-elisa） 5.梅毒螺旋体快速诊断试验（tp-rt） 其他方法: 梅毒螺旋体19s-igm抗体测定试验 梅毒螺旋体抗体试验（化学发光法）,2011.8.31,www.zhccdc.com,非梅毒螺旋体血清试验-trust,原理 vdrl-甲苯胺红ab（血清） 红色凝集物（肉眼观察） 方法,2011.8.31,www.zhccdc.com,非梅毒螺旋体血清试验-trust,结果 定性试验 阳性：出现由小至大的红色絮状物 （14）。 阴性：颗粒均匀、细小、不出现凝集。 定量试验 以出现阳性反应的最高稀释度作为最终滴度。,2011.8.31,www.zhccdc.com,trust凝集图像,2011.8.31,www.zhccdc.com,非梅毒螺旋体血清试验-trust,临床意义 1.非特异性反应的初筛试验，可用作疗效观察、判愈、复发或再感染指征。 2.初筛试验阳性可表示： 现症感染患者 接受治疗近期患者 生物学假阳性者,2011.8.31,www.zhccdc.com,非梅毒螺旋体血清试验-trust,注意事项 1.试剂保存 ，不能以下冰冻。 2.实验环境以2329 为宜，用前试剂恢复室 温。 3.试剂在效期内使用，怀疑试剂失效，需用试 剂阴、阳对照及已知阴、阳标本对照。 4.用旋转式摇床，不能用平衡式振荡仪。 5.试验要用纯血清，以防假阴性。 6.血清加抗原后要充分混匀分开。,2011.8.31,www.zhccdc.com,非梅毒螺旋体血清试验-trust,7.试验完毕立即观察结果，否则影响结果准确性。 8.定性阳性者，确诊治疗前应作定量试验，一是可以了解患者抗体滴度，便于复查作比较，以判断疗效和预后观察；二可以避免“前带现象”。 9.初筛试验阳性，应做确证试验以排除生物学假阳性。 10.aids合并感染梅毒，梅毒血清可阴性，应作暗视野检查螺旋体，同时做hiv检查。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验-tppa,一、tppa(梅毒螺旋体明胶凝集试验) 原理 tp-ag（明胶颗粒）ab（血清） 洋红 色凝集（肉眼观察）,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验-tppa,方法 定性、定量试验,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验-tppa,结果,定性试验 2+4+：颗粒凝集覆盖整个孔底，边缘粗糙 呈膜状。 1+：颗粒凝集呈多边性粗糙大环状。 +/-：颗粒浓集于孔底呈小环状 ：颗粒聚集于孔中央，边缘光滑呈小红点。 定量试验 出现阳性反应的最高稀释度作为最终滴度,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验-tppa,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验-tppa,临床意义,1. 确证试验阳性可诊断梅毒感染，一种是现症感染者，另一种是治愈者。 2.由于特异性梅毒螺旋体抗体可终生阳性，因此不能用来作为疗效观察及治愈的判断标准。一般只作定性试验，根据临床需要才做定量试验。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验-tppa,注意事项,1.反应板要清洁干净，遐免假阳性。 2.要用u形板不能用v形板，遐免假阴性。 3.试剂保存 ，不能以下冰冻。 4.反应温度以1830 为宜，用前试剂恢复至 室温。 5.试剂要在有效期内使用，不同批号不要混用。 6.血清要分纯，不能混有血液有形成分。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验-tppa,7.如未致敏颗粒出现凝集，应做吸收试验或 改用其它方法。 8.对于可疑阳性结果（1：80），建议作连 续观察或暗视野检查。 9. aids合并感染梅毒，血清学试验可阴 性，应作暗视野检查螺旋体。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验-tppa,方法学评价： 优点： 1、试剂稳定，批间差小 2、结果判读清晰明确 3、敏感性和特异性较tpha进一步提高 不足：结果判定主观，较难实现自动化。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验- fta-abs,二、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（fta-abs),tp-agtp-ab（灭活吸收后血清）,37 x30分钟,tp-ag-ab,pbs洗涤,tp-ag-ab+igg-fitc,37 x30分钟,tp-ag-ab-igg-fitc,pbs洗涤、封片、荧光镜检,莱果绿色荧光,2011.8.31,www.zhccdc.com,fta-abs igg抗体阳性（400）,2011.8.31,www.zhccdc.com,fta-abs igm抗体阳性（400）,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验- fta-abs,方法学评价： fta-abs是所有螺旋体试验中最敏感的方法，特异性也很高，被认为是检测梅毒的“金标准”，且该试验可分开检测igm和igg。但由于该试验需有优质的荧光显微镜和技术熟练的操作人员才能得到准确的结果，故常不被临床实验室作为常规方法开展。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验tp- igm,三、梅毒igm抗体血清学检测 临床应用,梅毒螺旋体感染人体， 机体体液免疫系 统最早产生的抗梅毒螺旋体特异性抗体是 igm ，然后才是igg。igm抗体滴度水平经 治疗下降较快并可转阴性。一期梅毒3 个月 阴转率100，二期梅毒9个月阴转率100 ，早期潜伏期梅毒2年阴转率100。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验tp- igm,因此，未经治疗患者igm抗体阳性可能是 活动性梅毒的表现。另外，由于igm聚合体 分子量较大，是igg的5倍，不能通过某些屏 障，因此对某些疑难病例的诊断具有重要意 义。igm检测主要应用于以下方面。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验tp- igm,先天性梅毒的诊断：igm不能通过胎盘屏 障，新生儿血清中igm阳性，说明怀孕期间 胎儿已被母体梅毒螺旋体感染而产生igm抗 体。 早期梅毒诊断：igm产生最早，理论上当其 它血清试验阴性时初筛试验、确证试验 （igg），可早期检测出igm抗体。 晚期梅毒诊断：由于不规则治疗或不治疗而 致的晚期梅毒病人，igm检测阳性。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验tp- igm,活动性神经梅毒诊断： igm抗体不能通过血 脑屏障，神经性梅毒活动期时，病人脑脊液 中存在igm抗体，检测可阳性。 梅毒螺旋体再感染：再次感染梅毒螺旋体， igm抗体重新出现，检测呈阳性。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验tp- igm,igm检测方法： fta-abs吸收法 fta-abs分离法 igm捕获elisa igm固相血球吸附法 免疫印迹法,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验tp- igm,免疫印迹法,原理 梅毒螺旋体抗原提取物用凝胶电泳分离并印迹在硝酸纤维薄膜上，印迹测试条的抗原与被检血清中特异性抗梅毒螺旋体igm（阳性血清）结合，其复合物再与抗人igm酶标记物结合，经底物显色后在印迹测试条上获得肉眼可见的色带。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验tp- igm,【材料】,1 tpigm试剂盒 印迹测试条 缓冲液（10） 酶标抗体（10x） 底物:直接使用 结果参照标准条 孵育反应槽 2摇摆式摇床,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验tp- igm,【方法】 1测试条处理：将恢复室温的测试条放入孵育反 应槽中，每槽1条，加入2.0ml缓冲液，置摇摆式 摇床室温摇摆5分钟,加入20ul待检样本，置水平 摇床（50转/分钟）反应45分钟。 2洗涤：弃去槽中液体，每槽加2.0ml缓冲液，置 摇床摇摆洗涤5分钟，共3次。 3酶标抗体孵育：吸去槽中缓冲液，每槽加入 2.0ml稀释（1：9）酶标抗体应用液，室温摇摆 孵育30分钟。,2011.8.31,www.zhccdc.com,4洗涤：重复操作2。 5显色：吸去槽中缓冲液，每槽加入2.0ml底物液，室温摇摆孵育8-10分钟。 6终止反应：吸去槽中液体，用去离子水或蒸馏水洗涤3 次。 7观察结果，将反应完毕的测试条小心用滤纸吸干，用塑料膜胶面贴于结果表上，将测试条与提供的标准条比较判断结果。,2011.8.31,www.zhccdc.com,梅毒螺旋体血清试验tp- igm,【结果判读】 1.阳性:45kd、17kd及15.5kd带区均出现显色带。 2.阴性:45kd、17kd及15.5kd带区均未出现显色带。 3.可疑:当45kd、17kd及15.5kd中只有一个或两个条带出现,需用其他试验方法复检。,2011.8.31,www.zhccdc.com,【注意事项】 1.整个反应过程要使用摇摆式摇床，以使反应完全。 2.洗涤要充分，可减少非特异性反应，以及避免底色过深影响结果观察。 3.中止反应洗涤次数和时间视具体情况而定，应以反应色带与测试条底色对比清晰为好。 4.试验完毕，立即观察结果。,2011.8.31,www.zhccdc.com,先天性梅毒的实验室诊断,暗视野、初筛试验、确证试验的方法均可 用，目前比较推荐使用19-sigm诊断先天性 梅毒。 先天性梅毒诊断确立可根据下列四个指标之 一：, 暗视野查到梅毒螺旋体 非梅毒螺旋体抗体滴度持续上升 非梅毒螺旋体抗体滴度高于母亲 梅毒igm抗体阳性,2011.8.31,www.zhccdc.com,神经性梅毒实验室诊断方法,近些年来，随着梅毒发病率的逐年上升，神经梅毒屡有报道。有报道13的一期梅毒和2540的二期梅毒患者csf发现异常；在未经治疗的晚期梅毒患者中，神经梅毒发病率可达 9.530。 神经梅毒的诊断除了临床症状外，主要依据是实验室诊断。目前神经梅毒的实验检测主要对患者的脑脊液（csf）进行相关梅毒感染指标检测，包括vdrl、tp-igm、fta-abs、tp-igg检测相对指数测定、tp-pcr 等。,2011.8.31,www.zhccdc.com,神经性梅毒实验室诊断方法,一、csf- vdrl,vdrl试验对神经性梅毒是特异的，是目前神经性梅毒诊断常用方法， csfvdrl阳性的特异性较高（90.6%），美国cdc2006年指南推荐神经梅毒的标准试验。但报道敏感性为3078，阴性时不能排除神经梅毒。,2011.8.31,www.zhccdc.com,神经性梅毒实验室诊断方法,脑脊液（csf） 检查结果 vdrl tppa/fta-abs 神经性梅毒 + + 非神经性梅毒 - -/+,2011.8.31,www.zhccdc.com,神经性梅毒实验室诊断方法,二、csf-tp igm,igm不能通过血脑屏障，如果csf中检测到tp-igm抗体，有助于神经梅毒的诊断，并可视为活动性神经梅毒，需要进行临床治疗。csf-tp-igm方法特异性可达100%，敏感性较vdrl试验高。,2011.8.31,www.zhccdc.com,神经性梅毒实验室诊断方法,三、csf- fta-abs,csf荧光tp抗体吸收试验（fta-abs）：首先 吸收csf中的非特异性tp抗体后，用免疫荧光 技术检测特异性tp抗体，是检测tp最特异敏感 的方法。由于tp的igg抗体可以穿过血脑屏障， 故csf-fta-abs可作为神经梅毒排除的标准实 验，即检测阴性时可排除tp在csf中的感染。,2011.8.31,www.zhccdc.com,神经性梅毒实验室诊断方法,四、csf-