小地老虎的生物测定.ppt

,小地老虎的生物测定 孙艺峰 140310250,小地老虎 苏云金杆菌 小地老虎高毒力苏云金杆菌菌株筛选,小地老虎,分类地位： 鳞翅目，夜蛾科。 幼虫又叫土蚕， 夜盗虫、截子虫等。,分布及危害：,分布广，食性杂，危害重。 以幼虫咬食农林果蔬等植物的幼苗嫩茎、茎基部组织，造成严重的缺苗断垄现象。,形态特征,成虫：体长1623mm。体色为暗褐色。触角雄性为双栉状，雌性为丝状。前翅棕褐色至黑棕色，后翅灰白色，外缘黑褐色，有明显的肾状斑，环形纹，棒状纹等。 卵： 扁圆形，直径0.5mm，表面有纵横隆线。 幼虫：体长3853mm，暗褐色，体表粗糙， 布满大小不等的颗粒。 蛹： 体长1824mm，赤褐色，有光泽。,生活史及生活习性：,在我国由北向南发生代别依次增加：东北23代，华北34代，华南67代。越冬北界线在北纬33以南。在此线以北的虫源来源于长江以南的越冬区迁飞而来。次年春季，越冬代成虫垂直飞行高度达4000米左右，迁飞距离可达1300公里，最远迁飞距离达1818公里。迁飞时凭借高空与地面气流，经升空运转迫降完成迁飞全过程。,小地老虎在我省每年发生2到3代。越冬代成虫盛发期在4月下旬至5月上旬，（此时又是产卵盛期，卵期713天），5月中下旬至6月上旬为第一代幼虫危害盛期。主要危害春播作物幼苗，尤其玉米、豆类受害严重。 幼虫取食特点：12龄咬食叶片半透明，3龄咬食叶片成空洞，46龄咬断茎。,幼 虫：,1. 13龄昼夜取食； 2. 46龄转移危害； 3. 假死性； 4. 耐饥饿习性； 5. 自相残杀。,成 虫：,1. 趋光性； 2. 趋化性； 3. 补充营养习性（35天）； 4. 产卵具有选择性（小旋花，刺儿菜、甜根芽根际）； 5. 迁飞习性（三条路径：西部、中部、东部）。,苏云金杆菌,Bt的应用前景,Bt的研究现状,Bt的杀虫机理,Bt的发现,简介,简介,苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis简称Bt ） 为革兰氏阳性土壤杆菌，遗传物质是DNA，属于芽孢杆菌属，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。可寄生在一些蛾类和蝶类的幼虫上，甚至是植物表面。它在芽孢形成过程中产生称为-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白，这些蛋白具有很高的杀虫活性。,Bt的发现,1938年第1个商品制剂Sporeine在法国问世，以后相继发现了有毒杀作用的Bt菌株。,日本学者石度繁从患病的家蚕幼虫中分离到第1个产生晶体的芽孢杆菌。,Berliner从德国苏云金地方一家面粉厂染病的地中海粉螟中分离到一个相似的菌株，并正式定名为苏云金芽孢杆菌（Bt）。,一个叫克林诺的科学家发现，在这种细菌的细胞中可以形成方形或菱形的晶体，可惜这个发现并未被重视。,一位叫汉纳的生物学家证明了这种晶体是有毒的蛋白质晶体，才揭示了粉螟死亡的原因。,Bt的杀虫机理,昆虫取食苏云金芽孢杆菌 杆菌在其胃肠道内产生蛋白质晶体内毒素（-内毒素）、热稳定毒素（-外毒素）、叶蜂毒素（-外毒素）及Bt-外毒素。而这种伴孢晶体对环境无毒无害。因为在动物的胃肠道内，酸性环境下蛋白质晶体不能溶解，从而对人畜无害。 毒素侵蚀昆虫肠道细胞，破坏肠道内膜，并进入血淋巴组织，使害虫因饥饿而出现败血症最后死亡。,苏云金芽孢杆菌的防治对象是鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目等多种害虫，其药性的持效期可达710d左右。需要特别注意的是：苏云金芽孢杆菌（Bt）及其制剂对蚕具有很高的毒性，桑园必须禁用。另外，勿与碱性杀菌剂混合施用，晴天的傍晚或阴天施药效果最佳。,Bt的研究现状,苏云金芽孢杆菌（Bt）的研究主要集中在分子水平上 过去Bt是作为一种制剂应用于农林害虫的防治，随着生物技术的发展，现在已对苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白质和相关基因作了深入而透彻的研究，也就是说在基因的水平上对它有了更多的了解。研究发现，在其体内具有一种Cry基因，正是这种基因编码产生的蛋白质对上述昆虫具有极大的毒性，所以这种基因的结构和特性就影响到它本身，也影响到它的杀虫范围。当然某一基因的长期应用会刺激昆虫产生抗体。因此，现在对苏云金芽孢杆菌的研究更多地集中在分子水平上。,苏云金芽孢杆菌在动物疾病防治上的应用,Bt的应用领域,苏云金芽孢杆菌在工农业生产中的应用,小地老虎高毒力苏云金杆菌菌株筛选,实验目的 目前国内对地老虎的防治仍以化学防治为主，生物报道较少，而苏云金芽孢杆菌对小地老虎研究目前还未报道，由于苏云金杆菌是应用最广泛的昆虫病原微生物之一，且其株系丰富，含有的杀虫晶体蛋白基因有较大的差异，因此杀虫谱范围会存在较大差异。 文章通过对30株Bt菌株对小地老虎幼虫室内的生物测定，以筛选出对小地老虎有较高毒力的Bt菌株，为研制和开发防治小地老虎的生物制剂提供依据。,材料与方法 1.1材料 1.1.1实验昆虫与食料 实验昆虫来源于东北农业大学园艺试验站内黑光灯下诱集的小地老虎成虫卵孵化出的幼虫。食料为新鲜灰菜叶片。 1.1.2实验菌株 由东北农业大学植物保护系害虫生物防治研究室周长梅老师提供，共30株菌株 1.1.3培养基 Bt培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，琼脂2%，Ph7.0-7.5。,1.2方法 1.2.1菌株培养和芽孢计数 采用试管斜面接种方培养法，在28培养箱中培养72小时。如图,刮取少量菌体，灭菌水洗3次，12000r/min离心10min,收集芽孢和晶体，用十倍稀释法将收集来的液体稀释1000倍，最后取1ml灭菌水悬浮沉淀，打到血球计数板上计数芽孢数，每菌株计数3次重复，以求得每小格芽孢数的平均值。,计算公式： 各个菌株原液芽孢浓度（cfu / ml)=每小格内芽孢平均数4 106 稀释倍数,1.2.2生物测定 室内生物测定方法采用灰菜浸渍法，将新鲜灰菜叶分别浸泡在30株芽孢浓度均为1 107cfu/ml的Bt菌液中，待整株叶片全部沾有菌液时取出，阴干之后饲喂4日龄小地老虎，并设清水对照，每处理设3次重复，每重复20头幼虫，幼虫饲养在25，相对湿度70%的人工气候箱中，每天更换一次新鲜的无毒饲料，在菌液处理72h.120h.168h后分别计算死亡率和校正死亡率,死亡率=（实验总虫数活虫数）实验总虫数100% 校正死亡率=（处理组死亡率对照组死亡率）（1 对照组死亡率）100%,实验结果： 通过实验我们发现Bt24,Bt25虫体大量死亡，虫体本身颜色发生变化，虫体发直，变腐变臭，触碰虫体会出现流能。说明虫体是感染细菌而死。,讨论 利用苏云金芽孢杆菌防治小地老虎是一种可行的生物防治措施，为小地老虎的生物防治开辟了新途径，本实验虽然发现某些苏云金芽孢杆菌可以使昆虫死亡，但对其杀虫原因Bt杀虫晶体蛋白的研究少之又少，这就需要我们在以后得分子水平上更加细致的研究与探讨。,参考文献,【1】陆琼，张永军，于洪春，等.Cry2Ab杀虫蛋白对小地老虎幼虫致死效果及体内酶活性的影响【J】.植物保护学报，2009,36(1)：16-20. 【2】束长龙，谷少华，窦黎明，等.对小地老虎具有杀虫毒力的苏云金芽孢杆菌菌株的分离及鉴定【J】.植物保护，2007,33(5):41-44. 【3】杨健全，李芳，等.苏云金杆菌对小地老虎的毒力测定【J】.福建农业大学学报，2000,29(1)：65-68. 【4】COSSENTINE J E. The experimental evolution on application microspondia against Agrotis ypsilon 【J】.Entomophaga,1987,31(4):510-512. 【5】SALAMA H S. Strengthen control result of Bt. Against Agrotis ypsilon 【J】. Jour Appl Entormol,1989,108(4):372-380. 【6】李瑞林.农业昆虫学【M】.北京：中国农业出版社， 【7】赵奎军，张丽坤，宋捷.应用斯式线虫防治8种鳞翅目，鞘翅目昆虫的研究【J】. 植物保护学报，1997,3(1):20-24. 【8】李永禧.小地老虎生活习性及防治【J】. 昆虫知识，200