胶体金快速免疫诊断技术讲解课件

Colloidal Gold Lateral-Flow Diagnostic Technology 胶体金免疫层析快速诊断技术,-闵微，研发部,快速检测,快速检测是一种廉价的、一次性的、基于膜的检测方法，它能提供分析物存在于液体样品的视觉证据。这种检测可以以独立的试纸条，也可以以装在塑料盒 中的形式进行。总的来说，做此项检测至少需要200ul 的液体标本，可在2至5分钟内完成。在临床检测中，样品可能有尿、血液、血清、唾液或其他体液。在非临床检测中，样本可能是由土壤、粉尘、植物或者食品制备的微量溶液， 它们同样可以直接应用膜试纸条检测。这种检测方法无需仪 器操作，可应用于临床、实验室、室外或者家庭通常为无操作经验人员使用。,2,快速膜检测需求广泛，可应用于诸多领域（见下表）。随着灵敏度和特异性 的提升，大量的潜在应用可能是作为替代昂贵仪器检测方法的低成本选择。,3,4,为何使用金标记,早期的快速检测使用有色胶乳形成可视信号，目前的某些检测仍使用此手 段。 过去和现在，乳胶法一直是凝集反应主要的标记方法，这是因为它在结合 成分的存在下易于凝集。对于快速检测而言，交联物的稳定性是避免假阳性的关 键，而易于凝集可能就是其产生假阳性的主要问题。 因为具有更好的潜在稳定性，20 世纪 80 年代末，金标记被引入膜快速检测 中。在适当的生产条件下，任何被精确大小的金颗粒都可以被重现性制造出来。 不同的大小可用于不同的用途。其优良的稳定性、敏感性、精确性及可重复生产 性等特点使得金适合于在快速检测中的应用。金本性属惰性元素，被适当加工可 形成完整的球形颗粒。当正确连接时，蛋白质能牢固地结合在金颗粒表面，无论 是液态或固态都能保持长久的稳定性。而且，若是在制造过程中蛋白被精确固定， 其与金交联物的非特异性结合可被减至零。,5,6,胶体金技术起源及现状,起源,1971年,Faulk 和Taytor引入,7,原理,免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。,8,现状,层析法(Lateral-Flow) 渗滤法(Through) 免疫金银染色法 胶体金的作用: 指示剂,9,10,与常规诊断方法相比,11,技术应用,12,胶体金层析法,一个快速检测的底层一般是硝酸纤维素膜，在它上面固 定了检测蛋白，通常是抗体或抗原。 连接着膜的是包含有干燥金标的金标垫（通常是玻璃 纤维）。对于目前大多数可做的检测项目，这种结合垫含有吸附了针对待检分析 品的特异性抗体或抗原的 金粒子。样品垫通常为纸 质，附着着结合垫。当使用 样品垫时，液体样品通过 毛 细扩散作用穿移过结合 垫，再水化金交联物，使待 分析样品与交联物相互作 用。然后金交联物与待分析 样品复合物转移至膜条带上再移向蛋白结合物，复合物在此处被固定后以一条细 细的红线的形式产生明显的信号。第二条线是控制线，由余下的金交联物形成于 膜上，表明测试完成。,13,试纸条组成结构,测试线 （T线）,控制线（C线）,胶体金垫,吸水滤纸,样品垫,NC膜（硝酸纤维素膜）,层析方向,PVC底板,14,层析法技术优势:简单现场快速,1.打开包装取出试纸条,2.直接插入待测样品中,3. 目测读出结果（3-10分钟内）,15,免疫层析法检测原理分类介绍 （双抗体夹心）,（以HCG检测为例）,16,免疫层析法检测原理分类介绍 （竞争反应）,（以吗啡检测为例）,17,免疫层析法检测原理分类介绍 （应用proteinA金标）,（以HIV检测为例）,胶体金渗滤法,将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。,18,胶体金银染色法,胶体金银染色法（DotIGSIGSS）是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法（DotIGS）。此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法（DotIGSIGSS）。,19,20,胶体金免疫层析系统 技术路线,21,技术路线,胶体金制备技术 标记技术 NC膜与溶液喷点 胶体金垫与溶液喷点 样品垫 吸水纸 粘性底板 干燥方法 溶液体系分析 装配切条包装,胶体金的制备,22,制备原理,所有的生产方法 都是使用还原剂提供电子给溶 液中带正电荷的金离子而产生 金原子，如下所示： 氯金酸还原剂胶体金 HAuCl4 + e = Au0 通常使用的还原剂包括柠 檬酸钠、黄磷、硼氢化钠、硫氰 酸钠。,23,24,根据不同的制备方法，可以制备出直径1500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。,25,以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径316nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.10.2的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备12150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。,26,白磷还原法制备5 nm胶体金,取250 ml三角瓶一个，加79 ml双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25 M K2CO3将溶液调至中性（pH7.0）。 取0.2 ml饱和磷/乙醚溶液加到1.5 ml试管中，再加0.8 ml乙醚，混匀。取0.7 ml加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用CuSO4进行中和)。 室温下轻轻摇匀15 min，然后加热沸腾并保持5 min，自然冷却。,27,单宁酸/柠檬酸钠法制备316 nm胶体金,取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1氯化金，预热至6070。 取一50 ml烧杯，加入4 ml 1柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至6070。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时，对pH的影响不大，K2CO3可以省略。 将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。自然冷却。,28,柠檬酸三钠法制备12-30 nm胶体金(Frens, 1973),取250 ml三角瓶一个，加100 ml双蒸水及1 ml 1%氯化金，加热沸腾； 取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30 min，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则颜色偏向紫色。,29,柠檬酸钠(ml) 胶体金(nm) 5 12 4 16 3 24 2.8 30,制备高质量胶体金的注意事项,（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理（1双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 （2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45m）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。 （3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。 （4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。 （5）氯金酸配成1水溶液在4可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20）。,30,由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。 胶体金溶液最好保存在4冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存1-2个月。但决不可保存在0以下，否则金粒子发生凝聚。,31,蛋白-金复合体的制备,32,必须了解蛋白与胶体金持久结合的物理及化学进程，仅仅把交联物揉合到一起， 虽然成本低廉且简易，却通常会导致聚集体的形成。 一种好的交联物表现为蛋白吸附于金的表面上，与胶乳不同的是，蛋白是被 动地吸附于交联物表面，因而不会出现共价结合。,33,一般认为胶体金粒子表面为一层AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。 金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值，这是因蛋白的净电荷取决于溶液的pH值，在pH=pI时为中性。由于在pH=pI时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中，一般胶体金调整为pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。 在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。,34,蛋白通过以下机制于几秒之 内吸附于金表面,金粒子所带负电荷与蛋 白内氨基酸（如赖氨酸） 所带阳性电荷的最初的 相互吸引 蛋白通过某些氨基酸残 基包括色氨酸与金粒子 表面之间的疏水吸附作用 蛋白中的半胱氨酸的硫基与金粒子间的配价结合,35,金颗粒大小的选择,检测信号是由金颗粒聚集于测试线或控制线而出现的信号。这些粒子必须足 够大到能被看见，粒子的尺寸越大，这 些粒子聚集后就越容易被看见。 随着粒子尺寸的增大，位阻现象又 成了一个问题。 此外，这些粒子的尺寸越大，它们在既定体积溶液中存在的数量越小。 这种可见度的需要与位阻现象之间的矛盾现象表明，对于大多数的免疫检测 应用而言，最适的粒子大小是 40nm。在某些情况下当位阻现象成为较大问题时 （如针对较小的抗原），20nm 的粒子则更为合适；当希望出现更深颜色或当分子表面较低的曲率提高了抗原抗体分子间的交互作用，较大一点的粒子则更为可 取。 应该由实验决定确定多少颗粒大小能带来高灵敏度、浅背景色和高稳定性。,36,37,蛋白必须要经过前处理,（1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。 （2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。 （3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30 kD），形成的金-蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响金-蛋白复合体的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长金-蛋白复合体寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的金-蛋白复合体。,38,39,抗体 Antibody,来源差异: 鼠抗,兔抗和羊抗 种类差异: 单抗,多抗 腹水的处理: 饱和硫酸铵沉淀法 特异性:亲和层析柱 浓度: 浓缩 溶解液:不含盐,例如PB,抗原抗体生物原料,抗原 Antigen,偶联抗原物质: BSA, OVA等 毒品检测来源: 合成抗原,待标记蛋白溶液的制备,将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4离心1h，去除聚合物。,40,确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值,对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同pH值得胶体金结合后，只有某一特定pH值能够形成结合最稳定的金-蛋白复合体。在高浓度电解质（如NaCl）作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜pH范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜pH值为最佳pH值。但有些金-蛋白复合体的实际情况并不完全如此，最稳定金-蛋白复合体并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。 这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定变化。,41,由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。 由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。 一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。,42,蛋白质最适用量的选择,加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加1020。 能够形成稳定金-蛋白复合体的蛋白的最小量。如果在制备金-蛋白复合体时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成金-蛋白复合体凝聚，并严重影响标记活性。因为金-蛋白复合体溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭”（Blocking）作用，而标记蛋白标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况下要特别注意。,43,胶体金标记蛋白的纯化,超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。 凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/51/10。再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400