分子生物学3ppt课件

3 生物信息的传递（上）,DNA,RNA,protein,mRNA (messenger RNA) tRNA (transfer RNA) rRNA (ribosomal RNA),DNA: 5 CGT GGA TAC ACT TTT GCC 3 编码链、有意义链 3 GCA CCT ATG TGA AAA CGG 5 模板连、反义链 mRNA: 5 CGU GGA UAC ACU UUU GCC 3 PROTEIN: N Arg Gly Tyr Thr Phe Ala C,转录,反转录,翻译,3.1 RNA转录的基本过程,特点： RNA是按5-3方向合成的。 以DNA双链中的反义链为模板。 由RNA聚合酶催化。 底物为四种三磷酸核苷（AUGC）。 不需要引物。,过程： 模板识别 转录起始 转录延伸 转录终止,3.1.1 模板识别,指RNA聚合酶与启动子（promoter）DNA双链相互作用并与之结合的过程。 启动子：基因转录起始所必须的一段DNA序列，是基因表达调控的上游顺式元件之一。 原核细胞：RNA聚合酶全酶能识别启动子区。 真核细胞：RNA聚合酶不能识别启动子区，需要转录调控因子按顺序结合到启动子上，RNA聚合酶才能与之结合形成转录起始前复合物（preinitiation transcription complex, PIC） 结合顺序：D-A-B-F-E-H TFII-D：首先与TATA区结合 TFII-A：稳定TFII-D与TATA区的结合 TFII-B：帮助RNA聚合酶与启动子区结合 TFII-F：与RNA聚合酶结合 TFII-E与TFII-H：促进转录开始,3.1.2 转录起始,二元闭合复合物 二元开链复合物 RNA聚合酶通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。,3.1.3 转录延伸,E.coli: 50-90b/s,3.1.4 转录终止,1. 弱终止子（依赖蛋白因子）,富含C缺少G的序列,2. 强终止子（不依赖蛋白因子）,3.2 转录机器的主要成分,3.2.1 RNA聚合酶,（依赖DNA的RNA聚合酶 DDRP） 以DNA为模板 5-3连续合成 需要Mg2+或Mn2+ 缺乏外切酶活性，没有校正功能 不需要引物,Yeast RNA Polymerase II,1. 原核生物RNA聚合酶,2 ,能提高RNA聚合酶与特异启动子的亲和力，也能降低与非特异启动子的亲和力。 新生RNA链达到6-9个核苷酸，形成稳定的酶-DNA-RNA复合物时，因子释放。,Sigma factors in E. coli: 70 (RpoD) - the “housekeeping“ sigma factor or also called as primary sigma factor, transcribes most genes in growing cells. Makes the proteins necessary to keep the cell alive. 54 (RpoN) - the nitrogen-limitation sigma factor 38 (RpoS) - the starvation/stationary phase sigma factor 32 (RpoH) - the heat shock sigma factor, it is turned on when exposed to heat 28 (RpoF) - the flagellar sigma factor 24 (RpoE) - the extracytoplasmic/extreme heat stress sigma factor 19 (FecI) - the ferric citrate sigma factor, regulates the fec gene for iron transport There are also anti-sigma factors that inhibit the function of sigma factors and anti-anti-sigma factors that restore sigma factor function.,RNA聚合酶横跨40bp,解旋区域约17bp,与DNA或聚合酶结合的大约20-30bp,2. 真核生物RNA聚合酶,RPB1/2与同源。 不同生物3类聚合酶有相似性 。 都存在两个大亚基。 有共享小亚基的倾向。 线粒体的聚合酶是最小的聚合酶之一（与T7同源）。 叶绿体的聚合酶是多亚基的。,RNA polymerase II 的结构,3.2.2 转录复合物,强启动子：从封闭复合物到开放复合物的转变时不可逆的。,合成并释放2-9个核苷酸的短RNA，即所谓流产式起始。,与转录起始复合物相比，延伸复合物极为稳定。,转录循环理论：,结合顺序：D-A-B-F-E-H,3.3 启动子与转录起始,3.3.1 启动子区的基本结构,启动子（promoter）是一段位于结构基因5端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确结合。,RNA 转录单元示意图,R:嘌呤 Y:嘧啶,Pribnow box,-80-110 GC -75 CAAT box,E. coli promoters,原核启动子的共有序列和共有间距,3.3.2 启动子区的识别,启动子的功能既受DNA序列的影响，又受其构象的影响，推测RNA聚合酶并不直接识别碱基本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。 （类似于酶与底物的结合）,RNA polymerase II pre-initiation complex model,3.3.3 RNA聚合酶与启动子区的结合,真核 原核,RNA polymerase passes through several steps prior to elongation,Adapted from S. P. Haugen, W. Ross, and R. L. Gourse, Nat. Rev. Microbiol. 6 (2008): 507-519.,扩展：,RNA polymerase (pol) II undergoes a cycle of phosphorylation and dephosphorylation at the C-terminal domain (CTD) during transcription initiation, elongation and termination. Initial promoter recognition and pre-initiation-complex formation occurs with an unphosphorylated CTD. Following transcription initiation, the CTD is phosphorylated on Ser5 by the transcription factor TFIIH, after which the polymerase often pauses. Transcriptional elongation is stimulated by P-TEFb (positive transcription-elongation factor-b), which phosphorylates Ser2 of the CTD. The CTD is dephosphorylated during and after transcription termination to facilitate a new cycle of transcription.,Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 810-815 (October 2008),carboxy terminal domain (CTD) composed of up to 52 heptapeptide repeats (YSPTSPS),3.3.4 -10区与-35区的最佳距离,原核生物中，-10区与-35区之间的距离大约是16-19bp，小于15或大于20都会降低启动子活性。 启动子下降突变： TATAAT-AATAAT 启动子上升突变： TATGTT-TATATT,3.3.5 增强子(enhancer)及其功能,1981年Benerji在SV40DNA中发现一个140bp的序列，它能大大提高SV40DNA兔血红蛋白融合基因的表达水平。它位于SV40早期基因的上游，由两个正向重复序列组成，每个长72 bp。目前发现的增强子多半是重复序列，一般长50bp，通常有一个812bp组成的“核心”序列，如SV40增强子的核心序列是5 GGTGTGGAAAG3。,绝缘子（insulator）是真核生物基因组的调控元件之一，亦为一种边界元件。功能为阻止临近调控元件，对它所界定基因的启动子其增强或者阻遏的作用。它对增强子的抑制作用具有极性，即只对处于其所在边界另一侧的增强子有抑制作用，而并不能抑制与其处于同一结构域的增强子。,增强子作用示意图,3.3.6 真核生物启动子对转录的影响,上游激活区,TATA区负责定位； CAAT区和GC区控制转录起始频率。 并不是每个启动子区都包含这三个元件。,转录调控因子,3.3.7 转录的抑制,DNA模板功能抑制剂 RNA聚合酶抑制剂,嘌呤和嘧啶类似物（5-氟尿嘧啶等），抑制核酸前体的合成。,3.4 原核与真核生物mRNA的特征比较,RNA,mRNA (2%) tRNA (16%) rRNA (80%),E. coli,原核生物： 不需要转录后加工；多顺反子；起始密码子通常是AUG（有时GUG、UUG）。 真核生物： 需要转录后加工；单顺反子；起始密码子永远是AUG。,线粒体和叶绿体以AUG、AUU、AUA 为起始密码子。,3.4.1 原核生物mRNA的特征,1 原核生物mRNA的半衰期短,现在一般认为，转录开始1分钟后降解就开始了。,2 许多原核生物mRNA可能以多顺反子的形式存在,多顺反子mRNA是一组相邻或相互重叠基因的转录产物，这样一组基因可被称为操纵子（operon）。,50SrRNA,30SrRNA,多顺反子的翻译,噬菌体：,3 原核生物mRNA的5端无帽子结构，3端没有或只有较短的polyA结构,SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。在细菌mRNA起始密码子AUG上游7-12个碱基处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA 3端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。,例子,原核生物mRNA很少经过加工，但在少数情况下多顺反子mRNA被核酸内切酶剪切成小片段，再作为翻译的模板。,3.4.2 真核生物mRNA的特征,一个完整的基因，不但包括编码区，还包括5和3端长度不等的特异序列。它们虽然不编码氨基酸，却在基因表达的过程中起着重要作用。 “基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。 真核生物mRNA结构上的最大特征是5端的帽子和3端的polyA结构。,1 真核生物mRNA的5端存在“帽子”结构,转录产物起始序列：pppApNpNp pppApNpNp.(50b) m7GpppApNpNp,Guanylyl transferase,0类帽子（cap0） 1类帽子（cap1） 2类帽子（cap2）占有帽mRNA总量10-15%以下。,帽子结构可使mRNA免遭核酸酶的破坏，而且有帽子结构的mRNA更容易被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质的合成（实验发现mRNA5端甲基化帽子是翻译所必需的，且有可能是蛋白质合成起始信号的一部分）。 The 5 cap has 4 main functions: Regulation of nuclear export. Prevention of degradation by exonucleases. Promotion of translation (see ribosome and translation). Promotion of 5 proximal intron excision. /wiki/5_cap,2 绝大多数真核生物mRNA具有多聚A尾巴,除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3端都有polyA序列，其长度一般为40-200左右。此序列是在转录之后加上的。 研究发现，几乎所有真核基因的3端转录终止位点上游15-30bp处的保守序列AAUAAA对于初级转录产物的准确切割及加polyA是必需的。但RNA聚合酶II却不在polyA位点终止，往往继续转录至polyA下游0.5-2kb的核酸序列。 polyA是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式，它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。,AAUAAA,多聚尾巴是在转录后，由内切酶切开mRNA3端的特定部位，然后由poly A 聚合酶催化多聚腺苷酸反应。此步骤依赖AAUAAA序列，能添加10个A；第二步不依赖AAUAAA序列，但需要一个识别poly A并指导poly A聚合酶延伸的刺激因子PABII。 mRNA刚进入进入胞质时，poly A尾巴较长（40-200），随时间推移将变短直至消失，随后mRNA将降解,CPSF：cleavage and polyadenylation specificity factor CstF： cleavage stimulation factor,3.5 终止与抗终止,到目前为止，尚未发现某个单一位点具有特异的转录终止功能。,3.5.1 不依赖于因子的终止,终止效率与反向重复序列和寡聚U的长短有关。长度增加，终止效率提高。,内在终止子：模板中存在的终止转录的特殊信号。,内在终止子的特点： 1. 终止位点上游一般存在一段富含GC碱基的二重对称区，其转录生成的mRNA容易互补形成的发卡式结构。 2. 终止位点上游一般有48个A组成的序列，转录生成的mRNA的3末端中相应的有一连串U序列。,3.5.2 依赖于因子的终止,有些终止点的DNA序列缺乏共性，不能诱导转录的自发终止，需要因子的参与。,因子：6聚体 NTP酶活性 解旋酶活性,“穷追(hot pursuit)”模型,3.5.3 抗终止,由于不同生理要求，转录过程中有时即使遇到终止信号，仍需要继续转录的现象。,1 破坏终止位点RNA的茎-环结构,当介质中某一氨基酸的浓度较低时，缺乏相应氨酰-tRNA，将致使核糖体滞留在串联密码子上，mRNA不能形成特定的二级结构，末端茎-环结构被破坏，因此转录仍将继续进行，出现抗终止现象。,例子：色氨酸操纵子,终止构型,抗终止构型,2 依赖于蛋白质因子的转录抗终止,3.6 内含子的剪接、编辑、再编码和化学修饰,转录作用产生出的 mRNA、tRNA及rRNA的初级转录本全是前体RNA或核不均一RNA，要经过剪接、编辑、再编码及化学修饰等加工过程才能变成有活性的RNA分子。 RNA的加工过程主要是在细胞核内进行，也有少数反应是在胞质中进行。,3.6.1 RNA中的内含子,真核生物的基因往往是断裂的基因，其转录所形成的RNA前体要经过剪切，将内含子切除后，将外显子拼接起来才能形成成熟的mRNA。 真核基因平均含810个内含子，前体分子一般比成熟mRNA大410倍。,内含子两端边界存在共有序列：（GU-AG法则）,在内含子内部部分序列也可能参与内含子的剪接，他们可能是pre-mRNA剪接过程中各种核糖核蛋白剪接调节因子的结合位点。,3上游18-50个核苷酸处：Py80NPy87Pu75A100Py95,3.6.2 mRNA的剪接,许多相对分子质量较小（长约106-185nt）的核内RNA（如U1，U2，U4，U5和U6）以及与这些RNA相结合的核蛋白(snRNP)参与RNA的剪接。 AG前一位核苷酸可以影响剪切效率： CAG=UAGAAGGAG 如果mRNA前体上同时存在几个AG，可能发生剪接竞争。,剪接前体,剪接体,U2 U5 U6作用的细节,在高等真核生物中，内含子通常是有序或组成性地从mRNA前体中被剪接。 然而变位剪接：,脊椎动物中大约有5%的基因是变位剪接。,不同形式的剪接,RNA剪接的调控,与mRNA前体中主要（GU-AG类）和次要（AU-AC类）内含子剪接方式不同，I、II类内含子能进行自我剪接。,生物体内各种内含子,3.6.3 RNA的编辑、再编码及化学修饰,1 RNA的编辑（RNA editing）,RNA的编辑是某些RNA，特别是mRNA前体的一种加工方式，如插入、删除或取代一些核苷酸残基，导致DNA编码的遗传信息的改变。 介导RNA编辑的机制有两种： 位点特异性脱氨基作用； 引导RNA指导的尿嘧啶插入或删除。,位点特异性脱氨基作用 载脂蛋白CU导致提前终止 由脱氨基酶催化,RNA的编辑不是很普遍。,脱氨基是由脱氨酶催化，在RNA编辑时脱氨酶亚基复合体能识别特异性靶位点。,尿苷酸的缺失和添加（利什曼原虫属细胞色素B mRNA中发现的）,RNA的编辑的生物学意义： 校正作用 有些基因在突变过程中丢失的遗传信息可能通过RNA编辑修复。 调控翻译 通过编辑可以构建和去除起始或终止密码子，是基因表达调控的一种方式。 扩充遗传信息 能使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物进化。,2 RNA的再编码(RNA recoding),mRNA在某些情况下不是以固定的方式被翻译，而可以改变原来的信息，以不同的方式进行翻译，科学上把RNA编码和读码方式的改变称为RNA的再编码。 RNA的再编码的表现方式： Frameshifting: 核糖体程序性+1/-1移位 Bypassing: 核糖体跳跃 Redefinition: 终止子通读（硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸）,HIV-1 genome (shows frameshift),Another example where a recoding event (1 translational frameshifting) sets up a fixed ratio between two polypeptide products is decoding of the E. coli dnaX gene, which encodes two subunits of DNA polymerase III, and . These two subunits are present in a ratio of 1:1 in the polymerase holoenzyme. The long form, , is synthesized by standard decoding. The short form, , shares its amino acid sequence with for the first two-thirds of the latter but has one additional amino acid at the carboxyl end. With the help of stimulatory signals in the mRNA, 50% of translating ribosomes switch to the 1 frame at the “slippery sequence” A-AAA-AAG, two thirds of the way into ORF1. The ribosomes that shift frame decode one codon in the new frame before terminating at a now in-frame UGA stop codon to synthesize .,Perhaps the best-studied example of the regulatory potential of recoding is the +1 frameshifting required for expression of E. coli release factor-2 (RF2). RF2 is a translational release factor that mediates termination at the stop codons UGA and UAA. RF2 protein is encoded by two partially overlapping reading frames. The first encodes only 25 amino acids. This peptide has no known biochemical function and is rapidly degraded. +1 ribosomal frameshifting at the last sense codon of the first ORF (ORF1), at the sequence CUU-U, results in the production of full-length functional RF2. Significantly, the stop codon of ORF1 is UGA, which is recognized only by RF2. A pause of translation at the shift site caused by low levels of RF2, contributes to +1 ribosomal frameshifting, thereby increasing synthesis of RF2 and closing an autoregulatory loop. In this way, the frameshifting site “senses” the levels of RF2 in the