发酵工程技术概论ppt课件

第八章 发酵工程技术概论,第一节 概 述,一、发酵工程（fermentation engineering）又称微生物工程： 通过微生物完整的细胞自催化完成生物化学反应过程，微生物既能正常生长又能过量积累目的产物，提供工业产品。 包括：抗生素，氨基酸，维生素，有机酸，酶制剂，蛋白质，基因工程药物，核酸类等。,二、发酵工程发展的4个阶段 （1）厌氧发酵的生产过程：如酒精，乳酸等。 （2）好氧（通气）发酵的生产过程：如抗生素、氨基酸、酶制剂等。 第一阶段：天然发酵阶段：传统的酿酒、制酱等。1675年荷兰人列文虎克发明了显微镜。法国巴斯德在18571876 持续研究发酵作用。 第二阶段：19001940人工控制微生物发酵过程（纯培养阶段 ），新产品酵母，甘油，乳酸，柠檬酸，丙酮和丁醇（第一个工业发酵产品） 第三阶段：通气搅拌技术阶段 （深层通气培养法），1942年青霉素工业化生产，1944年链霉素。 第四阶段：利用基因工程菌进行发酵阶段。,三、发酵工程的研究内容 生产菌种的培养和选育（菌种） 培养基制备（培养基） 发酵条件的优化与控制（搅拌通气，溶氧，发酵过程参数控制，反应器的设计） 产物的分离、提取与精制等（纯化） 菌种 工艺 设备,第二节 优良菌种的选育,一、菌种选育的物质基础 ：DNA 二、自然选育(spontaneous mutation) ：自发突变（正 负） 三、诱变育种 ：人工诱变 四、原生质体融合：基因重组,三、诱变育种 （一）方法和原理 1.诱变机制 （1）微小损伤突变：碱基置换，码组移动 （2）染色体畸变：易位，逆位，缺失，重复 （3）染色体组突变：数目变化（单倍体变多倍体） 2.诱变剂及其作用方式：物理诱变剂，化学诱变剂，生物诱变剂 常用诱变剂 p-263,（二）诱变和筛选 初步筛选是关键步骤 1.自身耐药突变株：耐受自身分泌的抗生素，提高产量 2.结构类似物或前体类似物的耐受突变株：解除反馈抑制 3.营养缺陷型及其回复突变株,通过诱变导致某些基因的突变，而需要添加一些物质（氨基酸、核苷酸等）才能生长的突变体。 营养缺陷型的作用： 解除末端产物的反馈调节作用。 作为标记，在杂交育种中作为出发菌株有利于杂交重组的分析。 作为基因工程的受体菌，检出克隆基因的表达。,3.营养缺陷型及其回复突变株,诱变包括：出发菌株的选择 诱变剂种类和诱变剂剂量的选择 合理的使用方法 筛选包括：初筛 重复筛选 突变株性能检测 直到获得新的优良菌株。,四、原生质体融合 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。 1.一般程序 2.影响融合的因素： 菌龄，培养基成分，PEG,外界因素（高渗溶液，酵母膏） 3.原生质体融合育种：真菌（蘑菇），细菌，植物（马铃薯、草莓、胡萝卜、烟草、矮牵牛、拟南芥、油菜、玉米、水稻、豌豆、甘蔗、柑桔、猕猴桃等）,原生质体融合 目前最成功且至今广为使用的是以PEG作为融合剂，对于所有种类的真菌而言， PEG诱导融合剂条件基本一致： (1) 原生质尽可能的幼嫩； (2) 原生质体要纯； (3) 最适的高渗稳定剂； (4) 用于融合的两菌株原生质体的浓度一般为107，两菌株总量为11； (5) PEG分子量为40006000，浓度为2540， (6) pH79在Ca2+存在下融合率可进一步提高。,融合子的检出 原生质体融合后，如何筛选融合子，是原生质体技术应用的关键。其方法有： 营养缺陷型互补选择 抗药性选择 灭活原生质体 荧光染色 分子标记选择 还可借助形态标记，自然生态标记等来初判异源融合子。,第三节 发酵的基本过程,一、菌种：04休眠保存，砂土管12年 二、种子的制备 ：摇瓶 种子罐扩大 生产 三、发酵：培养基，发酵罐参数 四、发酵液预处理 五、提取精制,温度2637，压力0.30.5kg/cm2，搅拌速度，通气量0.31m3/m3，接种量5%20%，pH，培养基体积、粘度、泡沫情况、菌丝形态、溶氧浓度、CO2 含量、总糖、氮、磷、产物含量等。 发酵周期一般28d,发酵罐参数,第四节 发酵方式*,一、分批(间歇)发酵：物料一次投入反应器中，灭菌、接种、发酵。 特点： 一次性；发酵过程中，营养不断减少，微生物不断增殖，环境非稳态；微生物生长的四个时期明显； 应用广泛，改善（在线检测，计算机控制）。 二、补料分批发酵 ：补加新鲜培养基。 特点：可以解除底物抑制、产物抑制或克服微生物过度生长；提高有用产物的转化率； 应用广泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业；,三、连续发酵： 恒化器（基质恒）、恒浊器（菌体密度恒），连续进料出料平衡，保持恒定的发酵液密度。易实现自动化生产，如啤酒，乙醇的发酵。 优点：操作稳定；利于机械、自动化；提高设备的利用率；减少灭菌次数；易于过程优化。 缺点：易染菌；微生物易变异；对产品类型的适应性不广；对设备及附件要求高。,第五节 发酵工艺控制,培养基的影响及其控制 温度的影响及其控制 溶氧的影响及其控制 pH的影响及其控制,一、培养基的影响及其控制 1. 碳源：糖类，脂肪，有机酸，碳氢化合物（速效碳源葡萄糖；迟效碳源淀粉，乳糖） 2. 氮源：无机氮源，有机氮源（速效氮源氨基酸，玉米浆；迟效氮源黄豆饼粉，花生饼粉、棉籽饼粉）。速效促生长，迟效利代谢。 3. 无机盐和微量元素 4. 水 5. 发酵培养基的配制 （1）提供必要的营养成分 （2）配制合适的浓度 （3）主成分与其他成分的配比 （4）控制合适的pH,培养基的主要成分 （1）碳源：是组成培养基的主要成分之一（菌体干物质的50%以上是碳）。 主要功能： 提供能源； 菌体成分； 产物碳架； 来源：葡萄糖、糖蜜、淀粉及水解物是常用的碳源。 （2）氮源：氮源也是培养基的主要成分之一（占干物质量的10%）。 主要功能：构成细胞物质。构成产物。 来源：花生粉、黄豆饼粉、玉米浆、铵盐、硝酸盐、尿素和氨水等是常使用的氮源。 （3）无机盐及微量元素： 主要功能：构成菌体成分（S）激活酶（Mg2+）辅酶或辅基的组成部分参与能量转移反应调节渗透压、pH、氧化还原电位 来源：无机盐、原料、灰分。 （4）特殊生长因子：不可缺、量微，自身不能合成或量不够。 主要功能：构成辅酶 促进生命活动 来源：玉米浆、糖蜜、甜菜糖、麸皮、米糠。 （5）水： 水是物质溶解和生化反应的基础。 功能：机体的重要组成成分；参加一些代谢反应；良好溶剂（介质）和热导体；,二、温度的影响及其控制 1.影响发酵温度变化的因素 （1）生物热：生长，呼吸，繁殖 （2）搅拌热：摩擦 （3）蒸发热： （4）辐射热：罐内外温差 2.温度的选择与控制 （1）最适温度：生长温度，生产温度 变温发酵，如青霉素发酵 305h 2535h 2085h 2540h 放罐； 青霉素产量比25恒温发酵高14.7% 。 （2）温度控制 一般不需加热，冷却水（冷冻盐水）通过夹层循环冷却。,三、溶氧的影响及其控制 1.溶氧的影响：最适氧浓度 溶氧对菌体生长和产物的性质及产量都影响 谷氨酸发酵 VB12发酵 天冬酰胺酶发酵 2.发酵过程的溶氧变化 红霉素发酵：前期，中期，后期 溶氧异常下降（污染好气杂菌，菌体代谢异常），溶氧异常升高（污染噬菌体） 3.溶氧浓度的控制 供氧方面（提高氧传递）；需氧量（菌体浓度，基质种类，培养条件）,四、pH的影响及其控制 1. pH对发酵的影响 最适生长pH（36） 最适生产pH 2. pH的变化 3. 发酵pH的确定和控制 （1）发酵pH的确定：菌种，培养基组成，培养条件，温度 （2）pH的控制：补料，酸，碱，尿素，测定代谢曲线的pH变化，稳定工艺条件。 常用的控制方法有：调整生理碱性和酸性盐类的比例；选择不同C、N的种类和比例；添加缓冲剂。,第六节 发酵产物的提取,吸附法 沉淀法 溶剂萃取法 离子交换法,培养液预处理的目的在于改变培养液的性质，使其便于过滤和提取。 细胞破碎的方法有机械、生物和化学等各种方法。 精制 一、吸附法：吸附剂（活性炭，白陶土，氧化铝）在一定的pH条件下使发酵液中的抗生素被吸附，然后改变pH，以适当的洗脱剂（一般是有机溶剂）把抗生素从吸附剂上解吸下来，以达到浓缩和提纯的目的。如丝裂霉素 还可以脱色和除热原 优点：操作简单，成本低， 缺点：吸附不稳定，选择性不高，不能连续生产，影响卫生，新型吸附剂（大孔树脂）,二、沉淀法: 抗生素等电点沉淀或与酸、碱、离子形成复盐沉淀析出，改变pH重新溶解。如土霉素，四环素，金霉素 优点：设备简单，节省溶剂，收率高 缺点：过滤较困难 三、溶剂萃取法 ： 改变pH，改变溶剂，改变溶解度 青霉素，红霉素，洁霉素，赤霉素，麦迪霉素，新生霉素，更新霉素，创新霉素。带溶剂（溴代十五烷基吡啶PPB）形成复盐。 优点：产品纯度高，浓缩倍数大，能连续生产，周期短 缺点：溶剂耗量大，成本高，设备要求高（溶剂回收，防火防爆）,四、离子交换法 带负电荷的酸性抗生素用阴离子交换树脂：万古霉素，杆菌肽 带正电荷的碱性抗生素用阳离子交换树脂：链霉素，卡那霉素，巴龙霉素，庆大霉素 优点：设备简单，节省溶剂，操作方便 缺点：pH变化大，周期长,理想的微生物细胞生物反应器的基本要求,1.生物反应器的材料无毒，稳定性好，一般用不锈钢制成 2.生物反应器的结构：满足传质、传热、混合的功能 3.密封良好，避免污染 4.自动检测、调节控制精度高 5.搅拌器转速和通气应适当 6.容器内表面光滑，无死角，利于清洁、灭菌 7.拆装、连接、清洁方便，能耐高压蒸汽消毒 8.设备成本低,第七节 发酵设备,主要参数的检测和控制方法, 温度，空气过滤 pH，灭菌系统,溶氧 搅拌 进出液流量,第八节 发酵工程产品的制造实例,一、青霉素：用发酵法制母体化合物 二、L-赖氨酸 三、维生素B2,一、基因工程在抗生素生产中的应用 二、基因工程在氨基酸生产中的应用 三、基因工程在维生素生产中的应用,第九节 基因工程在发酵工程中的应用,一、基因工程在抗生素生产中的应用 1、几种典型的抗生素生物合成基因簇的结构特点 链霉素（G+C含量70%） 青霉素、红霉素、氯霉素、链霉素、土霉素等，抗生素生物合成基因大多处于一个基因簇中（约1030个基因） 抗生素生物合成基因除定位在染色体上，还有的定位在质粒上，如次甲霉素A生物合成基因定位在天蓝色链霉菌的SCP1质粒上。,2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法 在标准宿主系统中克隆检测单基因产物（鸟枪法） 阻断变株法 突变克隆法：基因重组 直接克隆法：克隆整套生物合成基因，如头霉素C 克隆抗生素抗性基因法：抗性基因与合成基因连锁 寡核苷酸探针法： 同源基因杂交法：结构类似的抗生素有同源的生物合成基因,3、提高抗生素产量 （1）增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数 （2）通过调节基因的作用 （3）增加抗性基因 4、改善抗生素的组分 5、改进抗生素生产工艺： 克隆血红蛋白基因到抗生素产生菌中，提高细胞氧的利用率。,6、产生杂合抗生素 （1）生物合成途径中某个酶基因突变 （2）引入一个酶基因 （3）利用底物特异性不强的酶催化形成新产物 7、组合生物合成 微生物次级代谢