DNA的琼脂糖凝胶电泳.doc

DNA的琼脂糖凝胶电泳自1937年瑞典的Tiselius创造纸电泳以来，人们又创造了许多新的支持电泳的介质，其中较为常见的是琼脂糖及聚丙烯酰胺。普通琼脂糖凝胶制胶容易，能分离的核酸片段长度范围广（0.2-50kb）,可以区分相差约100bp的DNA片段；聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率（5bp）要高于琼脂糖，但它能分离的核酸分子通常1kb，且制胶等的操作远比制备琼脂糖凝胶来得麻烦。当DNA分子相当大，其双螺旋的半径超出凝胶的孔径时，如果还用普通琼脂糖凝胶电泳进行分离，则DNA可能跑不出胶孔。在这种情况下，应选用脉冲凝胶电泳。脉冲凝胶电泳可以区分相差几百kb的DNA片段。在本节中，我们主要介绍DNA的琼脂糖凝胶电泳。用于分离RNA的琼脂糖凝胶电泳，在胶的制备及所使用的缓冲液等方面与DNA有所不同，请参见相关的章节。 琼脂糖是从海藻中提取的线状多聚物。加热到90C左右，琼脂糖即可熔化形成清亮透明的液体，浇在模板上冷却后固化形成凝胶，其凝固点为40-45C。琼脂糖凝胶电泳是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应达到分离DNA混合物的目的。DNA分子在碱性条件下（pH8.0-8.3），碱基几乎不解离，而链上的磷酸基团解离，所以整个DNA分子带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子迁移速度取决于分子本身的大小和构型，DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在碱性条件下，单链DNA与等长的双链 DNA的泳动率大致相同。电泳装置琼脂糖凝胶电泳现大多使用水平电泳槽。较之早先的垂直电泳槽，水平电泳槽在凝胶的制备上比较灵活，且可使用低浓度的凝胶。由于水平电泳槽的两极是相通的，这样正负极的缓冲液也不会因为电泳时间久了而产生太大的差异。电泳缓冲液在电泳的过程中，H2O被解离，在阳极产生H+,而在阴极产生OH-，即阴极逐渐变碱而阳极逐渐变酸。因此，当带电荷的分子通过支持物介质时，需要使用缓冲液以维持电泳所需的pH值。核酸电泳最常采用的缓冲液有TAE（Tris，Acetic acid and EDTA）、TBE(Tris,Boric acid and EDTA)两种。由于这些缓冲液的pH是碱性的，这就使得整条DNA链上的磷酸骨架的净电荷为负，从而在电泳时能向正极泳动。TAE是最常用的电泳缓冲液。但TAE的缓冲能力弱，在长时间的电泳中缓冲能力逐渐丧失，因此长时间电泳时需循环或更换缓冲液。而TBE的缓冲能力较强，长时间电泳时不需要更换或循环。这两种缓冲液的配法如下：TAE（50母液）TBE（5母液）242.0g Tris 碱54.0 Tris碱57.1 ml 冰醋酸27.5 g 硼酸18.61 g Na2EDTA2H2O3.72 g Na2EDTA2H2O用蒸馏水定容至1升用蒸馏水定容至1升当DNA短于12kb且不需要回收时，用1TAE或TBE（0.5或1）进行电泳均可。如果片段较大，则最好使用TAE为缓冲液，同时将电压调低（1-2V/cm）。这样可减少DNA形成弥散带的机率。TBE则适用于分离12kb1-2V/cm琼脂糖凝胶的制备及电泳在进行琼脂糖凝胶电泳前，建议你最好测量一下你所用的塑料托盘的尺寸及所用的电泳槽两个电极间的距离。一般情况下，凝胶的最适厚度为3-5mm，根据这个标准及塑料托盘的长宽，就可以算出配胶时需要的缓冲液的量。知道了电泳时最适电压及两电极间的距离，就可选择合适的电压。1用橡皮膏封严塑料托盘开放的两边，水平放置托盘。逐一插入梳子，使梳齿距托盘底面约0.5-1mm。我个人的调节梳齿高度的经验是：在托盘底面上放置一块厚约0.5-1.0mm的薄片，将梳子垂直地放在薄片上，然后将梳子上的螺丝调节到合适高度，最后取走薄片即可。2.根据欲分离的DNA片段大小，配制适宜浓度琼脂糖溶液：准确称量琼脂糖干粉，倒入三角烧瓶或玻璃瓶中，加入适量的缓冲液（瓶子的体积应是溶液体积的2-4倍）。置微波炉加热至完全溶化，轻轻摇晃，充分混匀胶溶液，待胶冷却至60左右，在胶液内加入EB至终浓度为0.5g/ml（也可以不加，等电泳完毕再取出染色）。3.将胶液轻轻倒入托盘，使之形成均匀水平的胶面。凝胶适宜厚度为35mm。倒胶时一定要注意，不要让胶中留有气泡。4.在室温下放置3045min让胶凝固。小心拔出梳子，撕下橡皮膏带，将胶放进电泳槽内。向电泳槽加入电泳缓冲液，缓冲液高出胶面约3-5mm即可。5.混合DNA样品和上样缓冲液，用微量移液器将样品混合液及Marker缓慢加至加样孔内。 6.关上电泳槽盖，接好电极插头。调节后电压, 打开电泳仪开始电泳。如电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡，几分钟内溴酚蓝将从加样孔迁移进入胶体内。待溴酚蓝带移动至距胶前沿约1cm处，关上电源，停止电泳。7.小心地从电泳槽中取出凝胶，若配胶时未加EB，则按上述方法，用终浓度为0.5g/ml的EB水溶液染色20min,若已加EB,则可直接将胶放在凝胶成像仪中观察实验结果。注意事项1. 溴化乙锭为中度毒性、强致癌性物质，操作时需小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。2、预先加入EB时可能使DNA的泳动速度下降15%左右，而且对不同构型的DNA的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用 0.5g/ml的EB溶液浸泡染色。 参考文献李德葆 徐平，1994，重组DNA的原理与方法，浙江：浙江科学技术出版社。萨