细菌的分类与鉴定课件

黄海 2014.3,细菌的分类与鉴定,内 容,一、细菌的分类概述 （一）通用分类单元 （二）微生物的界级分类学说 二、细菌的分类和鉴定 （一）生物分类的两种基本原则 （二）细菌分类鉴定的指标 （三）细菌分类鉴定的实验室技术,一、细菌的分类概述 （一）通用分类单元 （二）微生物的界级分类学说,微生物分类学（microbial taxonomy）：是一门按微生物的亲缘关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群的科学。 具体任务 分类（classification） 鉴定（identification） 命名（nomenclature）,一、细菌的分类概述,命名(nomenclature)：根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称。,鉴定(identification或determination)：借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。,分类(classification)：根据一定的原则对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定。,（一）通用分类单元,七级分类单元： 界(Kingdom)、 门(Phylum)、 纲(Class)、 目(Order)、 科(Family)、 属(Genus)、 种(Species)。,大肠埃希氏菌 界：细菌界 门：变形菌门(Bacteria) 纲：-变形菌纲(Proteobacteria) 目：肠杆菌目(Enterobacteriales) 科：肠杆菌科(Enterobacteriaceae) 属：埃希氏菌属(Escherichia) 种：大肠杆菌种(coli),1.学 名,学名：一个菌种的科学名称，是按照国际细菌命名法则命名的，国际学术界公认并通用的正式名字。 俗名：普通的、通俗的、地区性的名字，如：用“结核杆菌”表示“结核分枝杆菌”，大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌。,采用“双名制”的国际植物命名法则。 “双名制”是瑞典植物学家林奈（Linneaus）于1953年介绍的植物命名原则，该方法已广泛用于植物、动物、微生物的命名。 “双名制”是用两个拉丁文或拉丁化的其他文字组成的一个学名。,2.学名的命名,学名由属名和种名组成 书写时：属名+种名； Escherichia coli 翻译时：种名在前，属名在后； 印刷时，学名用斜体字；书写时，在学名下加一横线表示斜体字母。 如：Aspergillus niger 或 Aspergillus niger 属名（曲霉） 种名（黑）,3.属 名,属名：表示微生物的主要形态特征、生理特征或以研究者的人名表示。单数，字首大写。 根霉属、毛霉属 ：形态特征 丙酸杆菌属、乳酸杆菌属 ： 生理特征+形态 特征 沙门氏杆菌属：研究者的人名 + 形态特征,4.种 名,种名：说明微生物的颜色、形状、用途，有时用人名、地名、微生物寄生的宿主名称和致病的性质来表示。字母小写。 黑曲霉 颜色 巴斯德酵母 人名 北京棒杆菌 地名 猪霍乱沙门氏菌 寄生的宿主名称和致病性质,种名未确定：属名加 sp.（单数）或 spp.（复数）表示。 Bacillus sp. 一种芽孢杆菌 Bacillus spp. 若干芽孢杆菌,5.亚种、变种的命名,亚种：subspecies，简称“subsp.” 变种：variety，简称“var.” 命名：三名法 属名 + 种名 + （subsp.或var.）+ 亚种（或变种）可省略 如：Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus 酿酒酵母椭圆变种 Bacteroides fragilis subsp. Ovatus 脆弱拟杆菌卵形亚种,6.新种的命名,新种：属名 + 种名 + sp.nov. 如：Corymebacterium pekinense sp. Nov. AS 1.229 北京棒杆菌AS1.229新种,菌株（在病毒中称毒株）：表示任何由一个独立分离的单细胞（或单个病毒粒子）繁殖而成的纯种群体及其一切后代。一种微生物的每一个不同来源的纯培养物均可称为该菌种的一个菌株。 菌株的名称放在学名的后面，可用字母、符号、编号、研究机构或菌种保藏机构的缩写来表示。,7.定名人、定名年份的表示,属名 + 种名 + （首次定名人）+ 现名定名人 + 定名年份 如：Escherichia coli (Migula) Castellani et Chalmers 1919 大肠杆菌 Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn 1872 枯草芽孢杆菌,（二）微生物的界级分类学说,生物分界是把地球上的所有生物按照形态、结构、生理功能、分布、生态等等特点而划分成一个个比较接近的各种生物类型集体的过程，生物分界是一项不断进行中的工作，随着科学的发展而不断深化。,阴影部分为微生物,二界系统：植物界和动物界 两界系统（林奈） 传统的分类认为界是最高级的分类单位。在林奈时代，他以生物能否运动为标准，将生物划分为两界，即植物界和动物界。将细菌、真菌等都归入植物界。,1.微生物的分类系统,二界系统,皂物（山毛榉科） 膏物（睡莲科） 核物（核果类） （豆科） （荠属） 丛物（芦苇属） 羽物 （鸟类） （龟类） （鳖类） （鱼类） （蛇类） 毛物（哺乳类） 裸物（人科） 小虫之属（相当于无脊椎动物）,荚物,植物,介物,鳞物,大兽（相当于脊椎动物）,动物,生物 （古代称“物生”）,三界系统：1866年E.N.Haeckel（赫克尔）提出动物界、植物界和原生生物界（单细胞生物、无核类）。由于显微镜的发明和使用，人们发现许多单细胞生物是有动、植物两种属性的中间类型的生物。如裸藻、甲藻等既可自养，有的也可异养生活。因而，赫克尔将原生生物（包括细菌、藻类、真菌和原生动物、黏菌等）另立为界，提出原生生物界、植物界、动物界的三界系统。,四界系统：1956年Copeland提出植物界、动物界、原始生物界（原生动物、真菌、部分藻类）和菌界（细菌、蓝细菌）。 五界系统：1969年R.H.Whittaker（魏泰克）提出动物界、植物界、原生生物界（原生动物、单细胞藻类、粘菌等）、真菌界（真菌和酵母）、原核生物界。 随着电子显微镜技术的发展，生物学家发现细菌、蓝藻细胞结构无核膜、无核仁及膜结构形成的细胞器，从而与其它真核细胞生物有显著区别，应该另立为界。于是，1959年，魏泰克根据细胞结构的复杂程度及营养方式的不同，将细菌和蓝藻、真菌从植物界中分出，分别另立为界，提出五界分类系统：原核生物界（包括细菌和蓝藻等）、原生生物界 (单细胞真核生物)、植物界、真菌界和动物界。,五界系统,它们组成了一个纵横统一的系统，从纵向上看，它显示了生命历史的三大阶段：即原核单细胞阶段、真核单细胞阶段和真核多细胞阶段（具有三个分支）。在横向上看，它显示了生物演化的三大方向：营光合自养的植物，为自然界的生产者；分解和吸收有机物的真菌，为自然界的分解者；以摄食有机物的方式进行营养的动物，为自然界的消费者（同时又是分解者）。,六界系统：1977年我国学者王大耜在Whittaker五界系统基础上增加病毒界。 三总界五界系统：我国学者陈世骧提出非细胞总界、原核总界（细菌界和蓝细菌界）、真核总界（植物界、真菌界、动物界）。,三原界系统：1978年R.H.Whittaker和L.Margulis提出古细菌原界、真细菌原界、真核生物原界。 分子生物学的发展，特别是rRNA 和rDNA的序列分析为整个生物界系统发育的研究提供了大量的数据。分子系统发育学已经表明，传统的魏泰克五界系统并不完全代表生物的五个进化谱系。伍斯（Woese）和伍夫（Wolfe）提出原核生物在进化上有两个重要分支，应将原核生物分为二界：古细菌界（甲烷菌、极嗜盐菌和嗜热嗜酸菌）和真细菌界（包括古细菌以外的其他原核生物，蓝藻、真细菌等）。真核生物分四界（原生生物界、真菌界、动物界和植物界）。因此，提出六界分类系统。1990年，伍斯根据分子生物学的研究资料，对生物分类提出新的建议，认为整个生物界可以区分为三个独立起源的大类群，即形成三个原界：古细菌原界、真细菌原界和真核生物原界。,三原界系统,二、细菌的分类鉴定,（一）生物分类的两种基本原则 （二）细菌分类鉴定的指标 （三）细菌分类鉴定的实验室技术,（一）生物分类的二种基本原则：,根据表型(phenetic)特征的相似程度分群归类，这种表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生物亲缘关系为目标。 按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系统发育的分类系统。,（二）细菌分类鉴定的指标,1.传统指标 2.分子生物学指标,1.生物分类的传统指标,形态特征 群体：菌落形态，在半固体或液体培养基中的生长状态等； 个体：细胞形态，染色反应，各种特殊构造等。,从不同层次，用不同学科的技术方法来研究和比较不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的反映微生物类群特征的资料。,生理生化反应 营养要求：能源，碳源，氮源，生长因子等； 酶：产酶种类和反应特性等； 代谢产物：种类，产量，显色反应等。,生态特性： 生长温度，对氧的需要，宿主种类等； 生活史特点： 在生活史中出现的菌体变化特点及其规律性； 血清学反应： 利用抗原构造上的差别进行鉴定； 噬菌体的敏感性； 其他,2.生物分类的分子生物学指标,DNA RNA,按照标准进行 传统的生化反应鉴定,标准化成品鉴定产品 （如：API试剂条）,半自动细菌鉴定仪 （如：ATB Expression）,色谱、光谱分析技术,分子生物学技术,1.生理生化检测技术 2.色谱、光谱分析技术 3.分子生物学技术,（三）细菌分类鉴定的实验室技术,人工鉴定,培养基的微量化、标准化和商品化,数码分类鉴定技术（生化反应的数字化）,自动化鉴定技术（生物信息的电脑化） 细菌的鉴定和药敏试验都实现了自动化,1.生理生化检测技术,前期准备,增菌,划线分离,染色镜检,血清,手工细菌鉴定,手工鉴定流程,1）双岐索引法,Example of methods for identification,The Bible of microbiologists-Bergeys Manual of Systematic Bacteriology,Bergeys Manual of Determinative Bacteriology-1st e 1923 Bergeys Manual of Systematic Bacteriology-2nd e 2001,伯杰氏细菌手册,早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。 目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和形成独特的不同细菌鉴定系统。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。,2）数码鉴定法,数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码,建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。 其基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。,数码鉴定法基本原理,微量生化反应系统Micro-ID系统, + + + + + + + ,0 2 0 0 2 1 4 0 0 0 2 1 4 0 0,2 3 4 3 4,相加所得数字：23434 查出相应细菌为：大肠埃希菌,项 目 分 值,数码鉴定法基本原理,先将细菌分离纯化。 做染色形态观察、氧化酶、糖发酵试验。 根据染色、氧化酶、糖发酵试验结果选择不同的生化反应板进行接种（同一个鉴定系统，配有不同细菌的生化反应板）。 培养后，读取生化反应结果，得到一组数据。 将这组数据查编码本（即数据库），即得到鉴定结果。,实验方法：,数码鉴定法基本原理,3）自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统,细菌数码分类技术是细菌自动化鉴定技术的基础，细菌鉴定自动化是把生化反应数字化技术进一步电脑化，数据库用电脑管理，结果用电脑分析和鉴定。 鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。 大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。,对标本同时进行鉴定与药敏测试,全自动细菌鉴定/药敏检测系统,鉴定部分： 51孔鉴定实验 改良经典实验 显色荧光检测,药敏部分： 85孔药敏实验 比浊氧化还原 实测倍比稀释MIC值 药物种类与浓度梯度 耐药机制检测同步进行,鉴定/药敏复合板设计,鉴定原理,45种反应底物。 检测板每20分钟检测一次,仪器判读结果,仪器自动记录每次判读的每个反应孔的结果。 将反应结果与上一次判读结果进行比较。 当两次结果没有差别，则该反应结束。 内置的运算法则：颜色比率的变化 依时间而变的数据库：2、3、4、6、12小时，依据每个测试周期的判读结果产生“百分比图”，如获得足够的信息，则给出鉴定结果。 标准菌量,可信度90，给出结果。,鉴定性能,鉴定能力 革兰氏阳性菌鉴定180种 革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性菌鉴定200种 革兰氏阴性发酵杆菌 革兰氏阴性非发酵杆菌 无需附加实验 95-96% 准确性,鉴定时间 minimum 1:26 hr maximum 12:25 hr average 3:24 hr median 2:26 hr 95th % 6:26 hr,鉴定仪性能,检测流程,纯培养新鲜平板上挑取菌落,制成标准浊度（0.50.6麦氏单位）的菌悬液,菌液加入肉汤中，倒入检测板，上机检测。,检测流程,扫描板条，输入资料，等待鉴定结果。,检测流程,2.质谱、色谱、光谱分析技术,MALDI-TOF 特征蛋白指纹图谱分析 FT-IR 红外光谱分析 FAME (fatty acid methyl ester) GC-MS脂肪酸分析 质谱： 定性、定量，可以推测物质的组成； 色谱： 定量，可分辨样品中的不同物质； 光谱： 定性，确定样品中主要基团，确定物质类别,质谱分析鉴定技术生物质谱,离子源 (MALDI) 质量分析器 Time of Flight (TOF),离子源 MALDI ESI,质量分析器 TOF Ion Trap (IT) Quadrupoles (Q) FTMS,+,质谱仪的类型 MALDI-TOF; MALDI-TOF/TOF ESI-TOF ESI-Qq-TOF ESI-Ion Trap ESI-triple Quadrupoles ESI (or MALDI or .) FTMS ESI (or MALDI or .) Q-q FTMS ,E=Uz=1/2mv2 和 t=L/V E：离子在加速电场获得的动能; U：加速电场电压 z：离子所带电荷; m：离子质量 v：离子飞行速度; L：飞行管道长度 t：离子飞行时间; c：常数 质量分析范围：500Da-100KDa,t = c m/z,MALDI-TOF质谱的原理,Laser,Sample plate,Acceleration grids,Drift tube,Ion detector,Mass spectrum,Vacuum system,Vacuum lock,几秒钟即可得到结果,MALDI-TOF-MS线性模式检测,Intensity,M/Z,Parent Ion,Gly,Leu or Ile,Lys,Pro,Phe,Ser+P*,Trp,Val,对多肽进行分析,绘制肽质量指纹图 (PMF),931.513,1046.555,354.201,400.216,110.064,517.260,647.358,756.390,263.147,0,1000,2000,3000,4000,5000,6000,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,m/z,绘制肽质量指纹图谱二级质谱图,931.513,1046.555,354.201,400.216,110.064,517.260,647.358,756.390,263.147,0,1000,2000,3000,4000,5000,6000,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,m/z,多肽的序列匹配鉴定,挑选菌落,样品制备于样品盘上,菌种鉴定结果,MALDI BioTyper 软件-数据库分析,获取质谱指纹信号,以蛋白为基础的分析方法 (Protein based approach),1.样品制备,2.质谱信号,3.菌种鉴定,质谱分析的细菌鉴定流程,直接涂抹法 (Direct Transfer ),单一菌种 (Pure culture),涂抹单一菌落于样品盘上 (Single colony on MALDI )Target,加上 1 ml 基质溶液 (Overlay with 1 ml HCCA Matrix),90-95% 以上的常规样品 可于此制备法得到鉴定结果,步骤 1：样品制备,质谱图:多数为核糖体蛋白(ribosomal proteins) 信号,大肠杆菌 (E.coli),步骤 2：采集谱图,Calculation of a matching score based on: Rel Score % matches of the reference spectrum (e.g. 6 / 10 = 0.6) Rel P-Num. % matches of the unknown spectrum (e.g. 6 / 20 = 0.3) I-Corr. value of intensity correlation,Unknown microorganism is matched against each Main spectrum in biotyper library. Ranking according to matching score, threshold for ID,MSP: Main Spectrum Peaks,步骤 3：数据库比对,Result Report | Detected Species | Ranking |act Sc |max Sc |Rel Score |PN k |PN b |PN m |Rel P-Num.|I-Corr.|1000*Pro - Spectrum #12 | Ps. mendocina DSM50017 | 1 | 3813 | 4271 | 0.89 | 41 | 10 | 83 | 0.55 | 0.88 | 438 | Ps. oleovorans B396 | 2 | 1671 | 3450 | 0.48 | 14 | 8 | 83 | 0.22 | 0.39 | 41 | Ps. fluoreszens B340 | 3 | 868 | 4186 | 0.21 | 6 | 7 | 83 | 0.11 | 0.19 | 4 | Ps. veronii DSM11331 | 4 | 847 | 4250 | 0.20 | 5 | 7 | 83 | 0.10 | 0.14 | 3 | Ps. putida DSM291 | 5 | 374 | 2821 | 0.13 | 3 | 3 | 83 | 0.05 | 0.12 | 1 | Ps. putida B401 | 6 | 329 | 2638 | 0.12 | 3 | 2 | 83 | 0.05 | 0.11 | 1,谱图模式比对进行细菌鉴定,微生物鉴定得分及含义,革氏阳性 (GRAM negative bacteria) 革氏阴性 (GRAM positive bacteria) 非发酵菌 (Nonfermenting bacteria) 厌氧性细菌 (Anaerobic bacteria) 酵母菌 (Yeasts) 丝状真菌 (Filamentous fungi) 数据库含括超过2,185种物种, 5,100 株菌株，超过100,000组质谱信号,Can I identify all kind of microorganisms?,68,69,MALDI Biotyper 1 样品 5 分钟 96 样品(整盘) 30 分钟 生化反应测试鉴定法 8 小时 数天,Can I identify microorganisms fast ?,Acetobacter aceti subsp. aceti Acetobacter pasteurianus subsp.lovaniensis Acetobacter pasteurianus subsp.pasteurianus Actinomadura aurantiaca Actinomadura libanotica Actinomadura livida Agrobaterium tumefaciens Arthrobacter globiformis Arthrobacter oxydans Arthrobacter pyridinolis Arthrobacter sulfureus Bacillus alcalophilus Bacillus cohnii Bacillus sphaericus Brevibacillus brevis Brevibacterium linens Cellulomonas flavigena Cellulomonas turbata Corynebacterium glutamicum Comamonas testosteronii Gluconobacter oxydans subsp. oxydans Gluconobacter oxydans subsp.oxydans Gordonia amarae Gordonia rubropertincta Gordonia terrae Halomonas denitrificans Halomonas elongata Halomonas elongata Halomonas halmophila Halomonas halmophila Hydrogenophaga flava Hydrogenophaga pseudoflava,Methylobacterium mesophilicum Methylobacterium organophilum Methylobacterium radiotolerans Methylobacterium rhodesianum Paracoccus versutus Paracoccus versutus Pseudomonas balearica Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens Pseudomonas oleovorans Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Pseudonocardia hydrocarbonoxydans Rhizobium leguminosarum Rhodococcus coprophilus Rhodococcus fascians Rhodococcus globerulus Rhodococcus rhodnii Rhodococcus rhodochrous Rhodococcus ruber Sinorhizobium meliloti Starkaya novella Starkaya novella Streptomyces albus Streptomyces avidinii Streptomyces azureus Streptomyces badius Streptomyces griseus Streptomyces hirsutus Streptomyces lavendulae Streptomyces phaeochromogenes Streptomyces violaceoruber Streptomyces viridisporus,4600种微生物菌株，可直接应用于微生物鉴定 用户可使用软件自行生成新的微生物的标准谱图 模式 并用于鉴定,质谱仪建立的微生物数据库（主库）,质谱仪在生物分析方面还可以做什么,蛋白鉴定和蛋白质组分析 定量蛋白质组学 细菌鉴定 血清多肽谱分析 核酸分析 分子成像,血清多肽谱的分析,血清样品,磁珠分离过程,数据分析,结果,疾病,正常,正常,Binding,Washing,Elution,MALDI TOF检测,正常组,疾病组,疾病诊断标志物的筛查,3000,4000,5000,6000,m/z,60,80,100,120,140,160,180,200,220,240,260,280,300,320,340,360,380,a.i.,核酸的分析,SNP 位点的检测,位点1,位点2,引物2,SNP位点检测的质谱图,引物残余,产物,纯合子,纯合子,杂合子,5000,7000,9000,m/z,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,a.i.,Polystyrene 7000,化学合成多聚物的分析,GC比例分析 分子杂交 DNA脉冲场凝胶电泳 16S rRNA寡核苷酸编目分析 分子指纹图谱分析 基因测序分析 其它,3.分子生物学技术,GC比例分析 DNA base composition(GC%),通过GC构成百分比判断同源性,分子杂交 DNA:DNA hybridization,DNA-DNA杂交,亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较,DNA-rRNA杂交,亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘关系比较,核酸探针,利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定,电子杂交,随着微生物基因信息，特别是全基因组完全测序的不断增加，我们可以通过各种计算机软件对不同物种的遗传信息进行直接比较，从而分析不同微生物间的亲缘关系。,16S rRNA寡核苷酸编目分析（Ribotyping）,分子指纹图谱（Molecular fingerprinting）,PCR扩增（PCR amplification） 限制消化酶切（Restriction digestion） 检测Probing (Southern blotting) 数据分析（Data analysis）,基因测序分析-第二代测序技术,Sample fragmentation Library preparation Sequencing reaction Data analysis,Roche 454 焦磷酸测序 Pyrophosphate Sequencing,Illumina Solexa 合成测序 Sequence by Synthesize,ABI SOLiD 连接法测序 Sequence by Ligation