氨磺必利是一种有效的5-HT7拮抗剂——与其体内抗抑郁作用有关.doc

氨磺必利是一种有效的5-HT7拮抗剂与其体内抗抑郁作用有关Abbas AI, Hedlund PB, Huang XP, Tran TB, Meltzer HY, Roth BL摘要背景 在欧洲许多国家，临床上氨磺必利已被批准用于精神分裂症的治疗，而在意大利，治疗适应症还包括：恶劣心境和轻度抑郁障碍。诸多临床研究结果提示，氨磺必利能有效治疗重性抑郁障碍。一直以来，大家认为氨磺必利抗抑郁、抗精神病的核心机制是其能够调节多巴胺功能，可选择性拮抗D2/D3受体。目的 本研究的目的旨在探索氨磺必利的抗抑郁效应是否受与其它受体相互作用的脱靶效应所调节。材料与方法 我们完成了如下实验：（1）氨磺必利对大量中枢神经系统分子靶点的药理学分析；（2）寻找5-HT7a受体的高效亲和拮抗剂，继而观察氨磺必利对野生型和5-HT7受体敲除小鼠的抗抑郁疗效。结果 本研究发现，氨磺必利是一种有效的5-HT7a受体竞争性拮抗剂，并与其它的分子靶点没有相互作用，这点也许能够解释该药在体内抗抑郁作用的机制。特别是与野生型同胞不同之处在于：在悬尾实验和强迫游泳实验这两种经典的抑郁症啮齿类动物模型中，氨磺必利对5-HT7受体敲除小鼠无治疗效应。结论 氨磺必利的抗抑郁作用可能与5-HT7a受体拮抗有关，而并非氨磺必利对D2/D3受体拮抗所致。关键词： 氨磺必利；5-HT7；5-HT7受体拮抗剂；抗抑郁药物；非典型抗精神病药物；DAN2163 前言氨磺必利是一种苯甲酰胺衍生物。作为选择性D2/D3受体拮抗剂，它起初被开发用于治疗精神分裂症（Perrault et al. 1997）。大量的临床试验证明，与其它抗精神病药物相比，氨磺必利治疗精神分裂症显示出疗效相当或更为有效（Racagni et al. 2004）。荟萃分析结果显示，氯氮平、氨磺必利、利培酮、奥氮平比第一代（典型）抗精神病药物和其它非典型抗精神病药疗效更显著（Davis et al. 2003; Leucht et al. 2009）。在临床实际使用过程中发现，氨磺必利EPS发生率较低，这也是其最类似于一种非典型抗精神病药物的地方（Leucht et al. 2002）。但与利培酮及典型抗精神病药物类似，氨磺必利由于有较强的D2/D3拮抗特作用，致使血清催乳素水平明显升高（Wetzel et al. 1998）。氨磺必利表现出D2受体高亲和力和5-HT2A低亲和力，这种药理学特性使之类似于典型抗精神病药物，然而在治疗方面，它却更像一种非典型抗精神病药物。研究显示，氨磺必利能够改善精神分裂症患者的注意力、执行功能、工作记忆、总体认知指数以及陈述性记忆（Deeks and Keating 2008; Mortimer et al. 2007）。但可能会损害正常人群的识别记忆功能（Gibbs et al. 2008; Mortimer et al. 2007）。有趣的是，在治疗精神分裂症和其它精神障碍的过程中，氨磺必利表现出抗抑郁效应（Kim et al. 2007; Montgomery 2002）。在意大利，氨磺必利已获准用于治疗恶劣心境，被认为是一种高效抗抑郁剂（Montgomery 2002）。事实上，Lecrubier等使用蒙哥马利和阿斯伯格抑郁症评估量表，对氨磺必利和丙咪嗪治疗恶劣心境、重性抑郁障碍进行了疗效比较，结果显示两者疗效相当（Lecrubier et al. 1997）。另外一项研究比较了氨磺必利和氟西汀治疗重性抑郁障碍、恶劣心境的疗效，结果显示两组等效（Smeraldi 1998），而且两组的有效率、不良事件数量以及脱落率也相当。实际上，至少已有6项临床研究表明，氨磺必利治疗恶劣心境和/或重性抑郁障碍的疗效与阳性对照药物类似（Racagni et al. 2004）。学者们普遍推测，对多巴胺信号的调节是氨磺必利抗抑郁效应的核心基础，这种推论主要源于该药能选择性拮抗D2/D3受体。事实上，多巴胺系统在抗抑郁效应中似乎在扮演一定的角色。许多不同种类的抗抑郁药物，包括氟西汀、氟伏沙明和去甲丙咪嗪，均能够增加大鼠前额叶皮质细胞外的多巴胺含量（Tanda et al. 1994; Jordan et al. 1994; Bymaster et al. 2002）。另一方面，舒必利另一种苯甲酰胺衍生物，也能选择性拮抗D2/D3受体，当将其注入强迫游泳实验的大鼠双侧伏核，而非尾状壳核时，会显著降低去甲丙咪嗪的抗抑郁效应（Cervo and Samanin 1987）。尽管舒必利在人体上表现出抗抑郁作用，但与阿米替林相比却弱很多（Drago et al. 2000）。总之，除了氨磺必利，其它苯甲酰胺类药物与5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）以及三环类抗抑郁药相比，未被确认具有抗抑郁效应。尽管有较为确切的证据表明，某些抗抑郁药物能够调节多巴胺系统，但除了上述一些现象学数据，并无直接证据显示选择性多巴胺受体拮抗剂（如氟哌啶醇）在单一治疗时具有抗抑郁效应，而且在该种情况下，其它靶点并未受到影响。另外，阿立哌唑被批准用于抑郁症的联合治疗，但它对抗抑郁剂起效过程中所涉及到的许多生物胺受体和转运蛋白均无靶标作用（Shapiro e al. 2003）。部分研究显示，抗抑郁药物联合奥氮平能够有效治疗难治性抑郁或双相抑郁障碍（Deeks and Keating 2008）。另外，喹硫平通过其主要代谢产物N-脱烃喹硫平（去甲喹硫平）有效抑制去甲肾上腺素转运蛋白，从而发挥抗抑郁效应，这个过程并未包含对多巴胺受体的任何直接作用。因此，我们试图验证氨磺必利的抗抑郁效应是否源于其对D2/D3受体的拮抗。通过筛选氨磺必利在中枢神经系统中的大量靶点，旨在分析和识别其抗抑郁作用的机制。材料和方法放射性配体结合分析放射性配体购于Perkin-Elmer 及GE医疗保健中心。使用转染或稳定表达的细胞膜进行竞争性结合分析，其详细制备过程如既往研究所描述（Shapiro et al. 2003; Roth et al. 2002），且供在线查询（）。表1罗列了关键信息，例如放射性配体成分和浓度、温育缓冲液和温育时间，额外信息可在线查询（/UNC-CH%20 Protocol%20Book.pdf）。Schild 分析稳定表达5-HT7a受体的细胞置于白色OptiPlate-96孔板（Perkin-Elmer）中培养过夜，使用含1%透析胎牛血清的DMEM培养基，每孔10,000个细胞。然后代之以测定培养基（DMEM培养基含2mM异丁基甲基黄嘌呤以及10 mg/100 ml抗坏血酸）在37预温育30分钟；上述测定培养基中每孔5L的氨磺必利按10倍稀释成7种终浓度（0、1、3、10、30、100和300nM）；5分钟后，每孔5L的5-HT按10倍稀释成8种终浓度（0、3、10、30、100、300、1000和3000nM）。该分析用于在没有氨磺必利以及不断增加氨磺必利的环境中，绘制5-HT剂量-反应曲线。反应过程在37条件下进行30分钟。使用GE公司的HitHunter cAMP XS试剂盒测定cAMP含量，方法同使用说明书。简言之，在30分钟反应的终末加入cAMP抗体，之后再立即加入Galacton-Star、Emerald-II、裂解液和cAMP XS+ED试剂以1:5:19:25的比例配制成的混合液。室温温育1小时后加入cAMP XS+EA试剂，然后置于室温温育1小时。使用标准-粒子计数器读取发光信号，并采用微软Excel以及科学图形计算软件Graphpad Prism进行数据处理。在Graphpad Prism中，球形拟合与Hill方程结合的改良Gaddum/Schild模型（Motulsky and Christopoulos 2004）。残差平方和的F检验用于判断Schild和Hill斜率是否显著不同于整体。实验动物实验动物为1012周的雄性5-HT7-/-小鼠及其5-HT7+/+雄性同胞对照。5-HT7-/-小鼠品系的来源在既往研究已有描述（Hedlund et al. 2003）。本研究所用之小鼠在C57BL6J的背景下至少回交16代。所有行为学实验始于09:00AM。小鼠处于24小时昼夜循环中（白天06:00AM开始，18:00PM结束），自由进食进水。所有的实验均遵循美国国立卫生研究院颁布的实验动物照护与使用指南，并获得斯克利普斯研究机构动物照护与使用委员会的批准。实验中尽量减少实验用动物数量，并减轻其痛苦。悬尾实验悬尾实验的步骤参考既往研究（Hedlund et al. 2005）。用黏带将小鼠的尾部固定在离台面50cm的金属杆上。为便于与既往研究进行比较，实验持续6分钟，在后4分钟计算小鼠不动时间。不动定义为没有任何肢体或躯干运动，但应排除呼吸运动。强迫游泳实验强迫游泳实验的步骤同既往研究所描述（Hedlund et al. 2005）。将小鼠轻轻放在一个直径16cm，高度25cm的圆形塑料水缸里，水缸中注入25C洁净水至水深10cm。实验持续6分钟，最后4分钟计算小鼠不动时间。不动定义为在水中没有任何水平或垂直运动，除外小鼠为将头部保持在水面以上而产生的小幅度运动。每只动物进行实验前均会换水。 药物治疗悬尾实验和强迫游泳实验前30分钟进行腹腔内注射。氨磺必利购自于Sigma-Aldrich公司。将药物溶解于以0.9%NaCl溶液配制成的50mM酒石酸中，注射的总体积为0.2ml。溶媒作为空白对照。数据分析所有数据以均数标准误（SEM）来表示。基因型和/或药物治疗之间的差异采用双因素方差分析，基因型和药物治疗各作为一个因素。方差分析之后采用Bonferroni法校正。使用GraphPad Prism软件包进行统计学分析；P0.05为差异具有统计学意义。结果氨磺必利对人5-HT7a受体具有高亲和力为明确氨磺必利抗抑郁作用的药理机制，我们采用受体组分析方法筛选了大量潜在靶点（Armbruster and Roth 2005; Table 1），并证实氨磺必利是一种有效的选择性作用于D2/D3受体的药物。氨磺必利对这两种受体的抑制常数Ki分别为（31）nM和（3.50.5）nM。然而该药物对于另外两种我们以前尚未确认的靶点也有较高的亲和力，分别是5-HT2b和5-HT7a受体。氨磺必利对5-HT2b受体的抑制常数Ki为（131）nM，与氚 麦角酸二乙胺（3HLSD）竞争结合5-HT7a受体的抑制常数Ki为（11.50.7）nM，而3HLSD与5-HT7a受体的平衡解离常数为6.6nM（Shen et al. 1993; Roth et al. 1994; Fig.1）。另外，氨磺必利对h5-HT1A受体以及对其它与抗抑郁药物药理机制有关的分子靶点亲和力低（Roth et al. 2004）。氨磺必利是一种有效的人5-HT7a受体拮抗剂最初的筛选证实了氨磺必利对人5-HT7a受体具有高亲和性。已知啮齿类动物和人类具有多种5-HT7受体的剪接变异体，但是5-HT对它们的亲和力和效能却没有差别。在大鼠体内，迄今为止最常见的亚型是5-HT7a（Heidmann et al.1998）。鉴于药物对不同的5-HT7剪接变异体具有一致的药理学特性，于是我们使用氨磺必利将其全部筛选后，着重研究了被高度表达的5-HT7a变异体。通过另一个竞争性分析，我们对自己的研究发现将加以详细说明。此次氨磺必利与3H5-CT竞争结合5-HT7a受体；后者对5-HT7a受体具有亚纳摩尔级亲和力（Thomas et al. 1998; To et al. 1995; Fig. 2）。3H5-CT优先标记高亲和力、激动剂结合位点，而3HLSD作为较弱的部分激动剂，则主要标记低亲和力、拮抗剂结合位点。我们推测，如果氨磺必利是5-HT7a受体的拮抗剂，它将优先削弱3H5-CT标记位点的亲和力。事实上，氨磺必利对3H5-CT标记的5-HT7a受体亲和力非常低（Ki=135.515.8 nM），这说明了它是拮抗剂。前一部分研究表明氨磺必利不会诱导cAMP堆积也证实了这一论点（数据未列出）。然后，在没有以及不断增加氨磺必利浓度的环境下，绘制5-H T激动5-HT7a受体的剂量-反应曲线，之后采用最小二乘法非线性回归来球形拟合改良Gaddum-Schild方程的量效曲线（Motulsky and Christopoulos 2004）。由图可见，随着氨磺必利浓度的不断增加，量效曲线平行右移，表明氨磺必利是一种可逆的竞争性拮抗剂（Fig.3）。残差平方和的F检验显示Schild斜率与1没有显著差异，表明氨磺必利是5-HT7a受体的竞争性拮抗剂。由球形拟合Gaddum-Schild方程所得的竞争性拮抗剂拮抗参数（7.940.08）估算平衡解离常数Kd为（11.40.8）nM，这与我们之前对3HLSD标记的受体位点抑制常数亲和力估算相一致。因而，氨磺必利对5-HT7a受体而言，是一种高亲和力的竞争性拮抗剂。5-HT7受体调节氨磺必利在体内的抗抑郁效应既然5-HT7a受体是氨磺必利在体内的新靶点，那么5-HT7受体有可能是其发挥抗抑郁作用的基础。如果是这样，那么氨磺必利对于5-HT7/小鼠则缺乏抗抑郁效应。既往有报道（Hedlund et al. 2005；Guscott et al.2005），在悬尾实验（TST）和强迫游泳实验（FST）中，如仅注射溶媒，5-HT7/小鼠比5-HT7+/+小鼠的不动时间更短。尽管两种抑郁症模型中氨磺必利的有效剂量不同，但是氨磺必利在5-HT7+/+小鼠中的量效曲线均呈“U”型（Fig.4）。TST中1mg/kg药物和FST中0.1mg/kg药物均能缩短5-HT7+/+小鼠的不动时间，这与预期的抗抑郁效应相一致。另一方面，对于5-HT7/小鼠，氨磺必利剂量在TST中低于10 mg/kg，在FST中低于1mg/kg的情况下，对不动时间并无影响，即未表现出抗抑郁效应。当氨磺必利剂量在TST中增至10 mg/kg，FST中增至1mg/kg时，5-HT7/小鼠不动时间显著延长至5-HT7+/+小鼠的水平，这可能是由高剂量氨磺必利产生的锥体外系反应所致。与之相似的是，高剂量氨磺必利（TST中3mg/kg和10 mg/kg，FST中3mg/kg和1mg/kg）致使原本在5-HT7+/+小鼠中表现出的明确抗抑郁作用消失。氨磺必利这种低剂量抗抑郁作用的特点与临床研究所报道的结果一致（Racagni et al. 2004）。讨论本研究显示，氨磺必利是一种有效的5-HT7a受体拮抗剂，这也是其具有抗抑郁效应的重要位点。氨磺必利独特的治疗反应很难由其已知的药理学特性来解释。研究表明，氨磺必利对突触前多巴胺自受体具有一定选择性，特别是在低剂量时选择性作用于边缘系统或纹状体，这一点可能与其治疗特点有关（Schoemaker et al.1997）。然而，值得注意的是，氟哌啶醇对突触前多巴胺自受体具有相似的作用，而事实上，另一种苯甲酰胺衍生物舒必利也表现出同样的边缘系统选择性（Schoemaker et al. 1997）。与氨磺必利相比，尽管舒必利也选择性作用于D2/D3受体，但它及相关的苯甲酰胺类药物，如雷氯必利、瑞莫必利和甲氧氯普胺并不与5-HT7受体结合（Roth et al. 1994）。虽然舒必利与氨磺必利的药理学特点非常相似，但前者在人体内的抗抑郁作用非常微小（Drago et al.2000），不仅如此，当它与抗抑郁剂联合使用于抑郁症大鼠模型时，甚至会使大鼠回复至抑郁状态（Cervo and Samanin 1987）。尽管几乎没有证据表明多巴胺能信号调节是氨磺必利发挥抗抑郁作用的充要条件，但抗抑郁剂能够调节前额叶皮质的多巴胺水平（Tanda et al. 1994），这进一步证明多巴胺在其疗效调节方面具有一定的作用。实际上，氨磺必利因其对D2/D3受体的选择性和临床上表现出的抗抑郁效应，被认为是唯一只依赖多巴胺能模式而发挥作用的抗抑郁药。然而，一方面这种调节多巴胺能的药物对抑郁症有效，另一方面，其它相关的苯甲酰胺类药物却缺乏抗抑郁效果，故推测氨磺必利的抗抑郁作用可能得通过其它的一些靶点来解释。为寻找迄今为止尚未被确认的氨磺必利的作用靶点，我们对多种克隆受体进行了平行筛选。筛选结果与既往研究相一致（Schoemaker et al.1997），表明氨磺必利相对选择性地作用于D2/D3受体。除此之外，我们还发现了另外两种以前未被报道的靶点：5-HT2B和5-HT7a受体。5-HT2B受体激动与心脏瓣膜病变有关（Rothman et al. 2000; Roth 2007; Berger et al. 2009），但诸如氨磺必利等5-HT2B受体拮抗剂（Huang et al.,待发表）则表现安全。目前尚无证据表明5-HT2B受体参与调节氨磺必利的治疗作用。另一方面，一直以来，大量研究认为昼夜节律调节、心境、睡眠结构、体温调节、抑郁行为（Hedlund and Sutcliffe 2004;Bergeret al.2009）的病因学机制，以及抗精神病药物的作用（Roth et al.1994）均与5-HT7受体有关（Shen et al. 1993; Lovenberg et al. 1993;Bard et al. 1993），进一步提示该受体可能是氨磺必利抗抑郁效应的候选靶点。事实上，本研究也发现氨磺必利是一种有效的5-HT7a受体竞争性拮抗剂，由此推测5-HT7a受体拮抗可能与氨磺必利的抗抑郁效果相关。为检验这一假设，我们采用体内实验的方法，预期氨磺必利对于5-HT7受体基因敲除小鼠无效。结果如预期所示，在悬尾实验和强迫游泳实验中，低剂量氨磺必利对5-HT7/小鼠无抗抑郁效应，而对其同胞5-HT7+/+小鼠却有效。这不太可能是由于5-HT7/小鼠较短的基线不动时间所造成的地板效应，因为SSRI类抗抑郁药西酞普兰能减少悬尾实验中5-HT7+/+和5-HT7/小鼠的不动时间（Hedlund et al.2005）。悬尾实验中，5-HT7+/+小鼠经氨磺必利治疗后，其不动时间约缩短25%，这与既往所报道的5-HT7受体拮抗剂SB269970的效应相一致，然而却不及西酞普兰之效果高达50%以上的不动时间缩短率（Hedlund et al. 2005）。最后，高剂量氨磺必利能延长不动时间，这与悬尾实验中D2/D3受体拮抗剂依替必利所产生的不动时间延长效应相一致（Ferrari and Giuliani 1997），进一步证明D2/D3受体的拮抗作用并不能解释氨磺必利的抗抑郁效应。因此，在悬尾实验和强迫游泳实验两种最佳的抑郁症动物模型中，5-HT7受体成为氨磺必利在体内发挥抗抑郁作用的关键调节位点。一些以5-HT7受体为靶点的药物效应研究与我们的假设高度一致。既往研究及本研究均显示，在悬尾实验和强迫游泳实验中，5-HT7/小鼠的不动时间显著短于5-HT7+/+小鼠（Hedlund et al.2005; Guscott et al.2005），提示减少5-HT7受体信号传导具有抗抑郁效应。SB269970（一种选择性5-HT7受体拮抗剂）能缩短悬尾实验和强迫游泳实验中5-HT7+/+小鼠的不动时间，而对5-HT7/小鼠无作用（Hedlund et al. 2005）。至少有另一项研究中证实了SB269970在悬尾实验和强迫游泳实验中的抗抑郁效应（Wesolowska et al. 2006）。最后，另一种5-HT7受体拮抗剂（SB258719）也被证实能显著缩短强迫游泳实验中的不动时间（Guscott et al. 2005）。值得注意的是，长期氟西汀治疗能下调下丘脑部位5-HT7受体表达（Sleight et al. 1995; Mullins et al. 1999），伴随着5-HT7受体信号的改变而逐渐显现的抗抑郁效应进一步证实，降低5-HT7受体信号传导有益于治疗抑郁症。抗抑郁治疗影响到的另一个重要生理学参数是睡眠。一直以来，睡眠结构改变被认为与抑郁症有关。抑郁患者表现出第一次进入快动眼睡眠（REM）的潜伏期缩短，但总REM睡眠时间延长（Brunello et al. 2000）。大多数抗抑郁药能使睡眠结构正常化增加REM睡眠潜伏期并减少总REM睡眠时间（Staner et al. 1999）。诸多研究提示，抗抑郁药物使睡眠结构正常化的能力与抑郁症患者的临床疗效呈正相关，但也有少部分研究无法重复该结果（Ott et al. 2002）。5-HT7受体拮抗剂SB-656104-A所引起的REM睡眠改变与大多数SSRI类和三环类抗抑郁药物相一致，即延长REM睡眠启动的潜伏期以及缩短总REM睡眠时间（Thomas et al. 2003）。此外，5-HT7/小鼠表现出较少的REM睡眠（Hedlund et al. 2005）。有研究表明，5-HT7受体被拮抗可能会影响神经元形态（Kvachnina et al. 2005），刺激海马神经发生（Nandam et al. 2007;Kodama et al. 2004）或与其它抗抑郁药产生协同作用（Xu et al. 2006），这与抗抑郁药物的作用机制相一致，因为部分研究认为抗抑郁药物的疗效与海马神经发生相关（Santarelli et al. 2003; Malberg et al. 2000），当然也有一些研究并不支持这一观点（Holick et al. 2008）。因此，如同我们所常用的SSRI类和三环类抗抑郁药，5-HT7受体拮抗剂也引起了很多相同的生理学改变。普遍认为氨磺必利是通过拮抗D2/D3受体来发挥其临床上的抗抑郁效应，这主要来自于两条推论。首先，在药物前期筛选过程中，氨磺必利表现出对D2/D3受体具有选择性，提示这个药物的任何治疗作用一定会受到这种机制的调节；其次，大量研究显示，抗抑郁药物会影响多巴胺和多巴胺受体，于是推测多巴胺能系统的变化可能是抗抑郁药物作用机制的重要环节（Dailly et al.2004）。但很多证据却使氨磺必利通过拮抗D2/D3受体来调节其抗抑郁效应的论点受到质疑。首先，也许也是最主要的，没有其它D2/D3受体拮抗剂，包括其它苯甲酰胺衍生物，在动物模型和人体中表现出非常有效的抗抑郁作用。其次，尽管很多有力的证据表明抗抑郁药治疗中会伴有多巴胺能的变化，但并不意味着这种现象是抗抑郁药物起效的关键性因素。本研究证实了氨磺必利能够阻断5-HT7a受体，这可能可以解释该药物的抗抑郁作用。研究显示慢性抗抑郁药治疗能够引起5-HT7受体功能变化（Sleight et al. 1995; Mullins et al. 1999）。此外，悬尾实验和强迫游泳实验中，与其同胞相比，5-HT7/小鼠不动时间较短（Hedlund et al. 2005; Guscott et al. 2005）。5-HT7a受体拮抗剂对抑郁症动物模型有效（Hedlund et al. 2005），并且对睡眠结构具有同大多数抗