核酸类药物课件

2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,1,核酸类药物,基 本 概 况,核苷酸生产工艺,三磷酸腺苷生产工艺,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,2,概 述,核酸类药物分为两类：一类为具有天然结构的核酸类物质, 这类药物已广泛用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等，属于这一类的核酸类药物有ATP、辅酶A、脱氧核苷酸等。第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物，这类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物，主要有三氟胸苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。,反义核酸技术及反义药物：反义技术是用人工合成的或生物中自然存在的寡聚核苷酸片断（反义DNA和反义RNA），结合目标基因或mRNA特定序列(靶核酸)，从而有效地抑制或封闭基因的转录与翻译。 反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程，即干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,3,概 述,核酸是由许多核苷酸以3，5-磷酸二酯键连接而成的大分子化合物。核苷酸由碱基、戊糖和磷酸三部分组成，碱基和戊糖组成的单元叫核苷。核酸类药物包括核酸、核苷酸、核苷、碱基及其衍生物。 依据化学结构和组成分四大类： 1 核酸碱基及其衍生物 2 核苷及其衍生物 3 核苷酸及其衍生物 4 多核苷酸,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,4,核苷酸的制备,核酸经酶、酸、碱水解生成核苷酸，然后分离提取制备各种核苷酸的方法通称水解核酸法。用催化剂的不同，分为酶水解、酸水解和碱水解等。 (1)酶水解 最常用的酶有桔青霉A.S3.2788产生的5磷酸二酯酶，也可用红酵母发酵所产生的3磷酸二酯酶。,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,5,核苷酸的制备,（2）碱水解法 在稀碱条件下，RNA容易水解得到2核苷酸和3核苷酸。实际上这是由于稀碱水解过程中，先形成一个中间环状物2，3环状核苷酸，它很不稳定，进一步水解生成2和3核苷酸。 稀碱水解的浓度随温度和作用时间的不同而异。用1M氢氧化钾或氢氧化纳在80下作用1h能使RNA水解成单核苷酸；用0.3M氢氧化钾或氢氧化纳在37下作用，要16h。,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,6,三磷酸腺苷生产工艺,三磷酸腺苷是体内广泛存在的辅酶，是体内组织细胞所需能量的主要来源，蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需ATP参与。ATP经腺苷酸环化酶催化形成环磷酸腺苷(cAMP)，是细胞内的生物活性物质，对细胞许多代谢过程有重要的调节作用。 ATP为蛋白质、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量，促使肝细胞修复和再生，增强肝细胞代谢活性，对治疗肝病有较大针对性。但外源性ATP不易进入细胞，且与体内需要的量比较，可能提供的量微不足道。,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,7,三磷酸腺苷生产工艺,白色类白色粉末，易溶于水，难溶于有机溶剂。在水中的溶解度具有氢型钠盐钡盐汞盐的顺序。在碱性溶液(pHl0)及低温下比较稳定。 ATP二钠是两性化合物。能与可溶性汞盐和钡盐形成不溶于水的沉淀物，利用这种性质可分离ATP。,1、化学结构和性质,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,8,三磷酸腺苷生产工艺,（1）工艺路线,2、以兔肌肉为原料,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,9,三磷酸腺苷生产工艺,兔肉松的制备 提取 取肉松加入4倍量冷蒸馏水，搅拌提取30min，过滤后再提取1次。合并2次滤液，冷处静置3h，经布氏漏斗过滤至澄清，得提取液。,2、以兔肌肉为原料,吸附 取处理好的氯型离子交换树脂装入层析柱，用pH3的水将柱平衡。提取液上柱流速控制在0.6一1ml(cm2.min)左右，吸附ATP。上柱过程中用DEAEC薄板检查。 洗脱饱和ATP柱，用pH3、0.03M氯化钠液洗涤柱上滞留的AMP、ADP及无机盐等，流速控制在1mL(cm2.min)。再用pH3.8、1M氯化钠液洗脱ATP，流速控制在0.3ml/(cm2.min)，收集洗脱液。操作温度在0一10。,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,10,三磷酸腺苷生产工艺,除热原、杂质 将洗脱液按总体积计加入0.6的硅藻土，0.4的活性炭搅拌10min，用4号垂熔漏斗过滤，收集ATP滤液。 结晶、干燥 用6M盐酸调滤液至pH2.53，在28的水浴中恒温,加乙醇，不断搅拌，使ATP二钠结晶，用4号垂熔漏斗过滤，分别用无水乙醇、乙醚洗涤，收集ATP二钠结晶，置五氧化二磷干燥器内真空干燥，即得ATP成品。次滤液，冷处静置3h，经布氏漏斗过滤至澄清，得提取液。,2、以兔肌肉为原料,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,11,三磷酸腺苷生产工艺,3、产氨短杆菌直接发酵法,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,12,三磷酸腺苷生产工艺,菌种培养 培养基组成葡萄糖10，硫酸镁1，尿素0.3，玉米浆适量，磷酸氢二钾1，磷酸二氢钾1pH7.2，接种量79，pH控制在6.87.2。 发酵培养 培养温度30，36h，投入腺嘌呤，加尿素、氢氧化钠和氨，控制pH。通风量1：0.5v(vmin)。 提取、精制 发酵液加热使酶失活后，调节pH33.5，过滤，分离除去菌体，上清液通过769活性炭柱吸附，用氨醇溶液洗脱，洗脱液再用CL-型阴离子交换树脂吸附ATP，经氯化钠盐酸液洗脱洗脱液经醇沉，过滤，丙酮洗涤，脱水，置五氧化二磷真空干燥器中干燥，得ATP品。,3、产氨短杆菌直接发酵法,2019/4/7,生物制药工艺学核酸类药物,13,三磷酸腺苷生产工艺,应用兔肌肉为原料的提取法生产ATP，曾采用三氯乙酸沉淀蛋白质，以钡盐和汞盐纯化ATP。此法耗用试剂多，成本高，易造成环境污染和直接危及操作人员身体健康。后改用蒸馏水提取AT