慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染.doc

慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染一、 包装1. 包装细胞Lenti-X Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P11）; Lenti-X shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P16)2. 病毒载体及包装质粒病毒载体：DNA组构建及中量提取；包装质粒：商品化产品（Lenti-X Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P12）; Lenti-X shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17)）或DNA中量提取（目前唯一使用来源）；3. 细胞转染方法一：Lenti-X Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P12）; Lenti-X shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17)；方法二：按照Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Cat.No.15338,invitrogen)进行，简要中文说明如下：a. 转染前24小时，把45 x 106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为8090%；b. 293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基；c. 用之前充分混匀PLUS Reagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G 的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUS Reagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube 1，温和混匀，室温孵育5分钟；d. 充分混匀Mix Lipofectamine LTX，在EP管中加入45ul的Mix Lipofectamine LTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube 2，温和混匀； e. 将Tube 1的溶液加到Tube 2中，温和混匀，室温孵育5分钟；Tube 1 (Plasmid DNA)Tube 2 (LTX)15ug DNA MIX(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)455 l Opti-MEM15 l PLUS Reagent45 l Mix Lipofectamine LTXUp to 500l Opti-MEM500 l Total Volume500 l Total Volumef. 将1 ml 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。g. 将细胞放入置于37 、5 %CO2 培养箱中培养，12小时后换上新鲜的培养基继续培养。h. 转染后48-72h，收取培养上清，500g离心10min或利用0.45 m 低蛋白吸附滤膜去除细胞碎片和团聚的病毒；方法三：C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf（目前唯一使用方法）4. 病毒上清收集转染后12h, 48h,72h分别收集一次；二、 纯化方法一：(i) 病毒上清（接一、包装 4.病毒收集）.(ii) Add 51 ml of a 50% PEG 6000 solution.(iii) Add 21.7 ml of a 4 M NaCl stock solution.(iv) Add 23.3 ml of PBS. This will result in a final volume of 300 ml. The final PEG 6000 concentration will be 8.5% and thefinal NaCl concentration will be B0.3 M.(v) Distribute the sample as 150-ml aliquots in two 250-ml polypropylene wide-mouthed bottles.(vi) Store the bottles at 4 1C for 1.5 h. Mix contents every 2030 min.(vii) Centrifuge bottles at 7,000g for 10 min at 4 1C using a Beckman fixed-angel JLA-10.500 rotor.(viii) After centrifugation, a white pellet should be visible.(ix) Carefully decant the supernatant and add 1.2 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, per bottle. Resuspend the pellets byvigorously pipetting liquid up and down.(x) Vortex the bottles vigorously for 2030 s to further resuspend the pellets.(xi) Transfer the vector suspension into screw-cap microfuge tubes in aliquots of 100 ml.(xii) Snap-freeze the tubes in crushed dry ice and store at -80 。C.a. 把去除细胞碎片和团聚的病毒上清转移至离心管，按照10ml的病毒上清加入2.5ml的50%PEG6000混合；b. 加入1.064ml的4M的NaCl混匀；c. 加入1.142ml的PBS混匀；d. 4C下，孵育1.5h，每20-30min颠倒混匀；e. 4C下，7000g离心10min。f.小心移除上清，切勿触动白色沉淀，如果白色沉淀出现松动，可以在7000 g下短暂离心；g. 加入原病毒上清1/200 to 1/100 体积的PBS重悬沉淀病毒粒子；h. 立即对浓缩纯化的病毒粒子进行滴度测定，并分装后（50-100ul/管）冻存于-80C超低温冰箱中；上述所需试剂配制方法见Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.pdf（P3）方法二：Lenti-X Concentrator.pdf三、 滴度测定病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc；病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc；四、 感染Lenti-X Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P16）; Lenti-X shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P20)；Lenti-X Concentrator.pdf（病毒感染增强剂使用说明）；a. 感染前24小时，把细胞传代至35 mm平皿中，加入完全培养基至终体积3ml，培养过夜，感染时，细胞密度为8090%；b. 把冻存