慢病毒实验方法.doc

慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定一、 试剂、耗材及仪器1.1 试剂1.1.1 商品化试剂及试剂盒名称厂家货号Lenti-X 293T Cell Lineclontech632180DMEMGibcoC11995500BTFetal Bovine Serum, Qualified, Australia OriginLife Technologies10099-141Lipofectamine LTX & Plus Reagent invitrogen15338QIAGEN Plasmid Midi Kit (25)QIAGEN121431.1.2 试剂配制a. 氨苄青霉素储液称取氨苄青霉素10g，加8ml 超纯水，溶解，定容至10 ml，过滤除菌，分装，-20保存。b. LB液体培养基称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加800 ml 超纯水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121/20min)，4保存。 c. 完全培养基把DEME培养基与血清按照9:1(V/V)进行混合。d. 50%PEG6000溶液 称取125gPEG6000用超纯水溶解，定容到250ml，分装，高压灭菌(121/20min)，4保存。e. 4M NaCl溶液 称取46.752gNaCl，加超纯水溶解，定容到200ml，分装，高压灭菌(121/20min)，4保存。f. PBS缓冲液 称取8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4.12H2O，0.27gKH2PO4，加800 ml 超纯水，调节pH至7.4，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121/20min)，4保存。1.2 耗材名称厂家货号25cm2 Growth Area Flaskscorning43063975cm2细胞培养瓶corning430641TC表面细胞培养皿，规格：35mmcorning430165TC表面细胞培养皿，规格：60mmcorning430196TC表面细胞培养皿，规格：100mmcorning4302936孔细胞培养板corning3516外旋盖冻存管corning43065915ml尖底离心管corning43079050ml尖底离心管corning45583毫升吸管Biologix30-0138A11.3 仪器名称仪器厂家仪器型号二氧化碳培养箱Thermo371生物安全柜ThermoForma Class II，B2倒置荧光显微镜OLYMPUSIX71台式高速冷冻离心机ThermoLEGND MACH 1.6R小型高速离心机ThermoLEGEND MICRO 17小型冷冻高速离心机ThermoLEGEND MICRO 17R超低温冰箱SANYOMDF-U73V冰箱HaierBCD-290W二、方法2.1包装细胞准备2.1.1. 细胞复苏a. 把完全培养基预热至37；用清洗洁净的500ml烧杯盛300ml超纯水，然后放入37水浴锅中，预热至37（至少需30min）；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理）；b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中），用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中；c. 把冻融的细胞立即转移至装有1ml预热完全培养基的15ml离心管中，混匀，立即加入4ml预热完全培养基，混匀；d. 加入5ml预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min），小心移除上清；e. 加入6 ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37）中培养；f. 24小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代；2.1.2细胞培养a. 当细胞达到80%融合时，移培养液，用PBS洗涤两次，加入1ml胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入6ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清，加入10ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取1*106细胞分装入新T75培养瓶，添加基至总体积为20ml，置于37 、5 %CO2 培养箱中培养；每隔23天传代1次，实验用第23代细胞。2.1.3细胞保种a. 冻存液：10DMSO，用血清来配制冻存液。b. 收取细胞：离当细胞达到80%融合时，换新的完全培养基，第二天，移培养液，用PBS洗涤两次，加入2ml胰酶消化液（T75培养瓶），把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入12ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清；c. 加入冻存液混匀，分装 至2ml冻存管中，密封后应标记冷冻细胞名称和冷冻日期，然后放入梯度降温盒，置于-80过夜，次晨置于液氮罐中保存。2.2. 质粒中量提取按照QIAGEN-Plasmid-Purification-Handbook-April-2012进行，简要中文说明下：a. 收集菌液30ml 4度离心6000 g，15min，彻底弃去上清，加入4ml Buffer P1，重悬菌体沉淀。b. 加入4ml Buffer P2温和地混匀（如果混匀充分，则溶液变蓝）。室温放置5min。c. 加入4ml Buffer P3立即温和地混匀（如果混匀充分，则溶液变成无色）, 冰上放置15min,20000 g，4度离心30 min。d. 将上清转移到一新的50ml离心管中，20000 g4度离心15 min。e. 在QIAGEN-tip中加入4ml的Buffer QBT，自然过滤。f. 将4步所得上清液加入QIAGEN-tip中，自然过滤。g. 在QIAGEN-tip中加入2X10ml的QC Buffer。自然过滤。h. 在QIAGEN-tip中加入5ml的QF Buffer，收集滤液。i. 在滤液中加入3.5ml的异丙醇，混匀15000g4度离心30min，去上清。j. 加入2ml70%的乙醇，15000g4度离心10min，彻底去上清，室温晾干5-10min。k. 加入80ul的灭菌水溶解沉淀，浓度测定。2.3 病毒包装按照Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Cat.No.15338,invitrogen)进行，简要中文说明如下：a. 转染前24小时，把45 x 106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为8090%；b. 293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基；c. 用之前充分混匀PLUS Reagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G 的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUS Reagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube 1，温和混匀，室温孵育5分钟；d. 充分混匀Mix Lipofectamine LTX，在EP管中加入45ul的Mix Lipofectamine LTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube 2，温和混匀； e. 将Tube 1的溶液加到Tube 2中，温和混匀，室温孵育5分钟；Tube 1 (Plasmid DNA)Tube 2 (LTX)15ug DNA MIX(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)455 l Opti-MEM15 l PLUS Reagent45 l Mix Lipofectamine LTXUp to 500l Opti-MEM500 l Total Volume500 l Total Volumef. 将1 ml 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。g. 将细胞放入置于37 、5 %CO2 培养箱中培养，12小时后换上新鲜的培养基继续培养。h. 转染后48-72h，收取培养上清，500g离心10min或利用0.45 m 低蛋白吸附滤膜去除细胞碎片和团聚的病毒；2.4 病毒浓缩纯化a. 把去除细胞碎片和团聚的病毒上清转移至离心管，按照10ml的病毒上清加入2.5ml的50%PEG6000混合；b. 加入1.064ml的4M的NaCl混匀；c. 加入1.142ml的PBS混匀；d. 4C下，孵育1.5h，每20-30min颠倒混匀；e. 4C下，7000g离心10min。f.小心移除上清，切勿触动白色沉淀，如果白色沉淀出现松动，可以在7000 g下短暂离心；g. 加入原病毒上清1/200 to 1/100 体积的PBS重悬沉淀病毒粒子；h. 立即对浓缩纯化的病毒粒子进行滴度测定，并分装后（50-100ul/管）冻存于-80C超低温冰箱中；2.5 病毒滴度测定a. 感染前24小时，把1x 105个/孔293细胞传代至96孔板中，加入完全培养基至终体积200ul；b. 把上述重悬的病毒粒子进行10倍梯度稀释，共12个梯度，用含4 g/ml polybrene的完全培养基进行稀释； c. 然后把90ul梯度稀释的病毒加入提前接种293细胞的96孔板中，培养液终体积为90ul，感染24小时后移除旧完全培养基，加入200ul完全培养基；d. 48-72小时后进行绿色荧光观察；如果稀释梯度为109的病毒感染细胞，48小时后具有绿色荧光的细胞的个数为4，则细胞浓度为4*109 cfu/ml。如此类推。2.6 病毒检测a.