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药 物 敏 感 性 试验 （比 例 法）,1,比例法原理,对照培养基(drug-free),含药培养基,所有菌落均生长,仅耐药菌生长,2,3,目的,用于诊断耐药结核病 结核病治疗方案的选择 用于耐药监测,药敏试验的基本步骤,含药培养基的制备-购置成品 菌液制备和稀释 接种 培养 报告结果,4,自制含药培养基,药物采购、药液制备、保存 基础培养基的制备 含药培养基的制备,5,*Proportion,WHO 推荐DST浓度,6,含药培养基的制备,药物储存液的制备： 在无菌容器内称取少量药物粉末，按不同药物出厂标定的效价精确计算其有效含量。 计算每种药物应加入的溶剂体积，使得药物浓度为：INH 20g/ml，SM 400g/ml，RRP 4000g/ml，EMB 200g/ml。 INH、SM和EMB用灭菌蒸馏水溶解，RFP用少量二甲基甲酰胺溶解后加灭菌蒸馏水至所需量。 制成储存液，分装冻存，备用。,7,含药培养基的制备,基础培养基：无淀粉改良罗氏培养基。 天门冬素 3.6 g (或谷氨酸钠7.2g ） KH2PO4 2.4 g MgSO4.7H2O 0.24 g 枸橼酸镁 0.6 g 丙三醇 12 ml 蒸馏水 600 ml 新鲜鸡卵液 1000 ml 2%孔雀绿 20 ml,8,含药培养基的制备,基础培养基制备： 盐溶液：精确称取各盐类成分，加蒸馏水600 ml，沸水浴溶解，待冷后, 加入丙三醇和 2%孔雀绿, 混匀。 鸡卵液：将新鲜鸡卵洗净，用75%酒精纱布擦拭消毒后打碎，搅匀，经消毒纱布过滤，定量至1000ml。 培养基基础液：将过滤后的鸡卵液加入盐溶液中，充分混匀，静置约1小时。,9,含药培养基的制备,每次制备培养基前取出1管储存液，室温融化，按实际需要量每100 ml基础培养基中加入1 ml药液，充分混匀。 分装至螺旋盖无菌培养管, 每管7ml, 斜置培养基蒸汽凝固灭菌器内, 85凝固50分钟，即制成含药培养基。 凝固灭菌后的培养基自然冷却后，置35-37孵育24小时。检查培养基污染情况后置4保存，1个月内用毕。,10,菌悬液制备,准备磨菌瓶 磨菌瓶为带有可密封螺旋盖的玻璃小瓶，装入约10个直径3mm的玻璃珠，高压灭菌后待用。,11,菌悬液制备,磨菌瓶法： 在磨菌瓶中加入12滴5%吐温-80，用无菌吸管尖端或灭菌接种环刮取2-3周的新鲜菌落，置于磨菌瓶中。注意尽可能刮取多处的菌落。旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上混旋约20-30秒。,12,取菌,13,磨菌,14,接触所有菌落,程序,Sterile distilled Water或5% 吐温80,玻璃珠,涡旋,静置15 min ,转移上清至比浊管,15,菌悬液制备,磨菌瓶法： 加入灭菌的生理盐水，直至其浊度与标准麦氏比浊管（MacFarland No.1）一致，即得到1mg/ml的菌液。,0.1 ml of 1% BaCl2 + 9.9 ml of 1% H2SO4,16,菌液稀释,菌悬液静置片刻，使其中的颗粒或菌块沉淀，用22 SWG标准接种环或微量吸管无菌操作逐步稀释至10-2mg/ml和10-4mg/ml。 22 SWG标准接种环：金属丝直径0.7mm，接种环内径3mm，1满环移液0.01ml。,17,稀释菌,McF No.1,DW 2ml,DW 2ml,0.02ml,1mg/ml,10-2,10-4,GC,H,R,S,E,0.01 ml (10-4 mg/ 10-6 mg),0.02ml,18,悬浮分散菌,分散前,分散后,19,接种及培养,用22 SWG标准接种环分别取1环 （即0.01ml ）10-2mg/ml和 10-4mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10-4mg和10-6mg。 接种后的培养基置于37培养，至四周后报告结果。,20,取菌液*,21,结果报告,按以下方式记录菌落生长情况： 少于50个菌落： 实际菌落数 50-100个菌落： 1+ 100-200个菌落： 2+ 大部分融合（200-500个菌落）： 3+ 融合（大于500个菌落）： 4+,22,结果报告,计算耐药百分比： 含药培养基上生长的菌落数 耐药百分比= - 100% 对照培养基上生长的菌落数 若耐药百分比大于或等于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药。,23,结果判读,对照 Isoniazid Ethambutol Inoculum 10-2 + + 3 10-4 26 9 0 % resistant 34.6 0.1 Interpretation Resistant Susceptible,24,质量控制,若高稀释度菌液（10-4mg/ml,低接种菌量）在对照培养基上生长的菌落数少于20个菌落，则应从对照管传代培养，重复试验。 每批实验均需增加H37Rv标准菌株，若标准菌株生长异常，则本批实验结果全部无效。,25,注意事项,选择新鲜、生长旺盛的菌落进行药敏试验，生长不良或陈旧菌株应传代后再进行试验 比浊、菌液稀释应力求精确，以保证接种菌量的准确。 下列操作应严格按技术规范进行，防止产生气溶胶：挑取菌落、磨菌、菌液稀释和接种、烧灼接种环。,26,实验室安全,实验室合理布局 涡旋振荡、接种时容易产生气溶胶，应注意正确操作 振荡后不能立即打开瓶盖，需静置片刻 接种时禁止反复吹吸 操作中一旦标本溅落，立即以5%石炭酸覆盖，至少30分钟,27,比例法药敏试验流程,基础液 改良L-J,对照培养基,含药培养基,药物储存液,混合、摇匀,100ml,1ml,磨菌,分装 凝固,分装 凝固,1mg/ml菌悬液,10-4 mg/ml,10-2 mg/ml,100倍稀释,100倍稀释,接种0.01ml,接种0.01ml,2-3周 新鲜菌落,28,练习：结果的解释,29,初步菌种鉴定,30,基于培养的检测,生长速度 是否产生色素 生长温度 典型形态 选择性抑制(PNB培养基),31,生长速度,快速生长: 1周内 不是 TB 生长缓慢: 通常 3 周, 有时达到6 周 可能为TB,32,生长温度,孵育: 36 +/-1C M.tuberculosis 在过低或过高 的环境下均不生长 42C 蟾分枝杆菌,33,色素产生情况,不产生色素 TB 产生色素,非TB,34,菌落形态,M.tuberculosis,35,菌落形态,M.chelonae(龟型分枝杆菌),M.Phlei（草分枝杆菌）,36,PNB选择性培养基,对照培养基 含PNB 培养基,37C孵育，28天后报告结果,药敏试验时选择10-2稀释浓度菌液用滴管或移液器接种0.1ml(2-3滴),37,PNB选择性培养基,结果报告 对照培养基和PNB培养基上均生长 非结核分枝杆菌复合群NTM 对照培养基上生长很好，但PNB培养基上未生长或几个菌落 结核分枝杆菌复核群 对照和PNB培养基上均未生长 不能判读结果需重做,38,非结核分枝杆菌复合群（NTM）,非结核性分枝杆菌（NTM)系指分枝杆菌属中，除结核分枝杆菌复合群(人型、牛型、非洲型和田鼠型结核分枝杆菌)和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，由NTM引起的疾病称为非结核性分枝杆菌病。 近年来由于检出率逐渐增多，相应的对其引起的各种疾病的认识也在逐渐提高。 非结核性分枝杆菌中大多数为腐物寄生菌，毒力低，属于条件致病菌。 非结核性分枝杆菌病的症状可有肺内、肺外之分，肺外感染可涉及皮肤、骨骼和淋巴结等。,39,NTM广泛分布于自然界的土壤、尘埃、流水和生牛奶中。显微镜下NTM形态与结核杆菌相似，抗酸染色呈红色，但在培养、生化特性与结核杆菌不同。,非结核分枝杆菌特点,40,非结核分枝杆菌特点,非结核分枝杆菌是否有致病性可用抗煮沸试验加以区别。 非致病株煮沸1min即失去抗酸性，而致病株能耐10min，甚至高压灭菌亦不失去抗酸性。 结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别，除热触酶试检外，可将菌苔置含盐水小滴的玻片上研磨，前者不易乳化而后者容易乳化。,41,由于许多非结核分枝杆菌菌株对常用的异烟肼、链霉素等耐药，但对利福平有一定敏感性;现多主张用利福平、乙胺丁醇和异烟肼联合使用。 溃疡分枝杆菌则仅对卡那霉素等氨基糖苷类抗结核菌药物敏感，但鸟-胞内分枝杆菌耐药性强;有报道分出的23株全部对上述药物耐药;而通