液相色谱仪器课件

高效液相色谱仪器,美国Agilent,美国Waters,美国戴安,日本岛津,美国VARIAN,日本岛津,德国诺尔,美国LabTech,大连依利特,进样前准备样品过滤,一次性注射器,针式（头）过滤器,样品瓶,1、注意滤膜种类（有机/水系） 2、混合后抽滤注意有机相可能比例变小保留时间变大，分离效果变化（特别滤的很慢时）。,Agilent 1100 在线脱气机,戴安的注意正相色谱时用的材料不一样。,Authoring Division Name File Name Security Notice (if required),Purge valve,Motor with Encoder,Outlet Ball Valve,Active Inlet Valve,泵的基本原理,串联泵,往复活塞泵(单向阀),弹簧隔板/红宝石球,串联柱塞泵 消除流量脉冲,并联柱塞泵 减小流量脉冲,低压四元泵,Agilent 1100 四元泵工作原理,Damper,Purge valve,Mixer,A,B,Inlet valve,Outlet valve,复式二元泵工作原理（串联单泵组合成高压二元）,Waters,仪器：手动进样器-六通阀/定量环,手动进样器工作原理,装填状态,样品注入,手动进样器,满环进样：应3倍以上体积，保证重现性。,六通阀滑片（显示沟槽）,机械手,样品盘,仪器：自动进样器,自动进样器结构,自动进样器工作原理,泵,柱子,柱温箱,外挂架,色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架,固定相-填充材料,填料硅胶的纯度 与残留金属离子浓度,固定相-填充材料,固定相-填充材料,固定相-填充材料,仪器：检测器,UV/Vis双灯，全波长检测,检测器,流路,仪器：检测器-紫外,反射镜1,反射镜2,氘灯,光源透镜,滤光片（钬玻璃/遮光）,入射狭缝,光栅,分光器,参比光电二极管 数模转换板,样品光电二极管 数模转换板,流通池,紫外检测器工作原理,Agilent 1100 可变波长紫外检测器(G1314A),DAD紫外检测器(G1315B),荧光检测器,蒸发光检测器,质谱检测器,高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法,一、 保留时间变化,1.柱温变化 2.等度与梯度间未能充分平衡 3.缓冲液容量不够 4.柱污染 5.流动相组成变化 6.柱快达到寿命,1.柱恒温 2.至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 3.用25mmol/L的缓冲液（*中药少用） 4.每天冲洗柱 5.防止流动相蒸发或盐沉淀在比例阀 6、采用保护柱,二、 保留时间缩短,1.流速增加 2.样品超载 3.键合相流失 4.流动相组成变化 5.温度增高不稳,1.检查泵,重新设定流速 2.降低样品量 3.流动相PH值保持在37.5 检查柱的方向 4.防止流动相蒸发或盐沉淀在比例阀 5.柱恒温,三、 保留时间延长,1.流速下降 2.硅胶柱上活性点变化 3.键合相流失 4.流动相组成变化 5.温度降低,1.管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 3.流动相PH值保持在37.5检查柱的方向 4.防止流动相蒸发或沉淀 5.柱恒温,四 、 出现肩峰或分叉,1.样品体积过大 2.样品溶剂过强 3.柱塌陷或形成微小涡流通道 4.柱内烧结不锈钢失效 5.进样器损坏,五、 鬼峰,1.进样阀残余峰 2.样品中未知物 3.柱未平衡 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 5.水污染(反相),1.每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.处理样品 3.重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱) 4.每天新配,用抗氧化剂 5.通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水,六、 基线噪声,1.气泡(尖锐峰) 2.污染(随机噪声) 3.检测器灯连续噪声 4.电干扰(偶然噪声) 5.检测器中有气泡,1.流动相脱气,加柱后背压 2.清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂 3.更换氘灯 4.采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) 5.流动相脱气,加柱后背压,七、 峰拖尾,1.柱超载 2.峰干扰 3.硅羟基作用 4.柱内烧结不锈钢失效 5.柱塌陷或形成短路通道 6.死体积或柱外体积过大 7.柱效下降,八、峰展宽,1.进样体积过大 2.在进样阀中造成峰扩展 3.数据系统采样速率太慢 4.检测器时间常数过大,1. 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 2.进样前后排出气泡以降低扩散 3.设定速率应是每峰大于10点 4.设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%,八、峰展宽,5.流动相粘度过高 6.检测池体积过大 7.保留时间过长 8.柱外体积过大 9.样品过载,5.增加柱温,采用低粘度流动相 6.用小体积池,卸下热交换器 7.等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 8.将连接管径和连接管长度降至最小 9.进小浓度小体积样品,1 . 3 流动相反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统(采用紫外末端波长检测时，首选 乙腈-水系统），如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流 动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C 18链在水相环境中不 易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机 溶剂的比例通常应不低于5 % ,否则C 18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系 统不稳定。,药典附录规定,各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱 柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏 度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比 例时，以组分比例