课件：肿瘤标志物检验.ppt

第十七章 肿瘤标志物检验,第一节 概 述 第二节 肿瘤标志物测定,肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病。 为了提高对肿瘤的早期检测、鉴别诊断、疗效观察以及预后判断，人们从肿瘤细胞的化学特性、细胞病理、免疫反应和基因表达产物等诸多方面寻找各种特异性强、灵敏度高的肿瘤标志物。肿瘤标志物的研究对肿瘤的诊断有极其重要的意义。,第一节 概 述,一、肿瘤标志物的概念 所谓肿瘤标志物，指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞合成、释放，存在于组织、细胞或体液中，反映肿瘤存在和生长的一类物质。通过对这类物质的分析，能帮助人们从正常组织中区别肿瘤或测定肿瘤细胞核、细胞质以及对细胞膜上的特性进行分析，以此作为辨认肿瘤细胞的标志。,理想的肿瘤标志物应该具有下列条件： 1. 标志物的含量变化应与肿瘤的生长、消退、转移有直接的定性或定量的比例关系。 2. 标志物应具有较高的特异性，能比较明显地区别于正常人群和良性肿瘤。 3. 能在临床上尚未确定肿瘤前检测出来。 4. 检测这类标志物的方法简便，易推广，而且成本较低。,二、肿瘤标志物的分类 肿瘤标志物的分类常用的有两种：其一按肿瘤标志物的来源以及它的特异性，可分为两大类。 1.肿瘤特异性标志物 是一种肿瘤所产生的特异性物质。例如前列腺特异性抗原（PSA）就是前列腺肿瘤所产生的特异性标志物质，只有患前列腺癌时，PSA才会显著性升高。 2.肿瘤辅助标志物 由一类组织类型相似而性质不同的肿瘤产生，其含量有较大的变化。这类标志物往往易同良性肿瘤或正常组织发生混淆。,第二是按肿瘤标志物本身的化学特 性，可分为以下几类： 1. 肿瘤胚胎性抗原标志物 AFP 2. 糖类标志物 CA19-9 3. 酶类标志物 PAP 4. 激素类标志物 HCG 5. 蛋白质类标志物 2m 6. 基因类标志物 ras,三、肿瘤标志物的临床应用 近年来，肿瘤标志物在临床上已得 到较广泛的应用， 目前主要应用于： 1. 肿瘤的普查； 2. 肿瘤高危人群的筛选； 3. 肿瘤的诊断和鉴别诊断； 4. 肿瘤监测； 5. 肿瘤分类、分期、定位； 6. 肿瘤治疗。,第二节 肿瘤标志物的测定,一、胚胎性抗原标志物的测定 在人类发育过程中，许多原本只在胚胎期才具有蛋白类物质，应随胎儿的出生而逐渐停止合成和分泌，但因某种因素的影响，特别是肿瘤状态时，会使得机体一些“关闭”的基因激活，出现了返祖现象，而重新开启并重新生成和分泌这些胚胎、胎儿期的蛋白。,胚胎类肿瘤标志物,这类蛋白虽然与肿瘤组织不一定都具有特定的相关性，但与肿瘤的发生存在着内在的联系，故被作为一种较为常见的肿瘤标志物。,（一）甲胎蛋白（AFP） AFP主要是由胎肝细胞和卵黄囊合成的单一多聚体肽链的糖蛋白。其分子量平均为70ku，含糖4。AFP在电场中泳动于-球蛋白区，是胎儿血清中的主要蛋白质。1964年Tatarinov发现肝癌患者血清中检测到AFP。 【参考范围】成人血浆AFP浓度低于25g/L。,【临床意义】AFP是原发性肝癌的最灵敏、最特异的肿瘤标志物，80%以上的原发性肝癌患者血清AFP明显增高，AFP检测诊断肝癌的标准为：血清AFP测定结果大于500g/L持续4周；AFP含量有不断增高者；血清AFP测定结果大于200g/L持续8周。,肝癌患者血清AFP含量变化的速率和程度与肿瘤组织分化程度高低有一定相关性，分化程度较高的肿瘤AFP含量常大于200g/L。 血清AFP含量的检测对其它肿瘤的监测亦有重要临床价值。如睾丸癌、畸胎瘤、胃癌、胰腺癌等患者血清AFP含量可以升高。,（二）癌胚抗原（CEA） 癌胚抗原是1965年Gold和Freedman首先从胎儿及结肠癌组织中发现的，CEA是一种分子量为22ku的多糖蛋白复合物，45为蛋白质。一般情况下，CEA是由胎儿胃肠道上皮组织、胰和肝的细胞所合成，通常在妊娠前6个月内CEA含量增高，出生后血清中含量很低。 【参考范围】成人血清2.5g/L。,【临床意义】 当CEA大于60g/L时，可见于结肠癌、直肠癌、胃癌和肺癌。CEA值升高，表明有病变残存或进展。如肺癌、乳腺癌、膀胱癌和卵巢癌患者血清CEA量会明显升高，大多显示为肿瘤浸润，其中约70为转移性癌。一般来说，手术切除后6周，CEA水平恢复正常，否则提示有残存肿瘤，若CEA浓度持续不断升高，或其数值超过正常5-6倍者均提示预后不良。,二、糖类抗原标志物的测定 肿瘤标志物相关物质是指由肿瘤细胞表面的抗原物质或者是肿瘤细胞所分泌的物质，这类物质含糖量高，故又称为糖类抗原（carbohydrate antigen，CA）。这类标志物出现为临床肿瘤的诊断带来方便，糖类抗原标志物产生可分为两大类，即高分子粘蛋白类和血型类抗原。,糖类高分子粘蛋白抗原肿瘤标志物,血型类抗原肿瘤标志物,这类抗原标志物的命名是没有规律的，有些是肿瘤细胞株的编号，有些是抗体的物质编号，常用检测方法是单克隆抗体法。 （一）CA19-9 CA19-9是1979年Koprowski等用结肠癌细胞免疫小鼠，并与骨髓瘤杂交所得116NS19-9单克隆抗体，它是一种分子量为5000ku的低聚糖类肿瘤相关糖类抗原，其结构为Lea血型抗原物质与唾液酸Lexa的结合物。 【参考范围】血清CA19-9含量为216U/ml（RIA法）。,【临床意义】 CA19-9是胰腺癌和结、直肠癌的标志物。血清CA19-9阳性临界值为37U/ml。胰腺癌患者85以上为阳性。肿瘤切除后CA19-9浓度会下降，如再上升，则可表示复发。结直肠癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌和胃癌的阳性率也会很高，若同时检测CEA和AFP可进一步提高阳性检测率。良性疾患时如胰腺炎和黄疸，CA19-9浓度也可增高，但往往呈“一过性”，而且其浓度多低于120U/ml，必须加以鉴别。,（二）CA125 CA125是一种大分子多聚糖蛋白，是重要的卵巢癌相关抗原。分子量为200ku，加热至100时CA125的活性破坏。 【参考范围】血清CA12535.0U/ml（RIA法）。 【临床意义】 CA125是上皮性卵巢癌和子宫内膜癌的标志物。当卵巢癌复发时，在临床确诊前几个月便可呈现CA125增高，尤其卵巢癌转移患者的血清CA125更明显高于参考值。动态观察血清CA125浓度有助于卵巢癌的预后评价和治疗控制，经治疗后，CA125含量可明显下降，若不能恢复至正常范围，应考虑有残存肿瘤的可能。,（三）CA15-3 CA15-3是一种乳腺癌相关抗原，于1984年由Kufu和Hilkens等人发现，CA15-3分子量为400ku，分子结构尚未清楚。 【参考范围】血清CA15-328U/ml（RIA法）。 【临床意义】乳腺癌患者CA15-3明显升高，也是监测乳腺癌患者术后复发的最佳指标，当CA15-3大于100U/ml时，可认为有转移性病变，其含量的变化与治疗结果密切相关。肺癌、胃肠癌、卵巢癌及宫颈癌患者的血清CA15-3也可升高，应予以鉴别，特别要排除部分妊娠引起的含量升高。,（四）CA50 CA50是1983年Lindholm等从抗人结、直肠癌Colo-205细胞株的一系列单克隆抗体中筛选出来的，对结、直肠癌有强烈反应。所能识别的抗原称CA50。CA50存在于细胞膜内，其抗原决定簇为唾液酸Lea血型物质与唾液酸-N-四氧神经酰胺。 【参考范围】血清CA5020U/ml（RIA法）。,【临床意义】 CA50是胰腺和结、直肠癌的标志物，因CA50广泛存在胰腺、胆囊、肝、胃、结直肠、膀胱、子宫，当细胞恶变时，由于糖基转化酶的失活或胚胎期才能活跃的某些转化酶被激活，造成细胞表面糖类结构性质改变而形成CA50，因此，它又是一种普遍的肿瘤标志相关抗原。所以在多种恶性肿瘤中可检出不同的阳性率。,三、酶类抗原标志物的测定 酶及同工酶是最早出现和使用的肿瘤标志物之一。在肿瘤标志酶中根据来源可将其分为两类： 1.组织特异性酶：因组织损伤或变化而使储存在细胞中的酶释放，如前列腺特异性抗原等； 2.非组织特异性酶：主要是肿瘤细胞代谢加强。特别是无氧酵解增强。,酶类肿瘤标志物,在酶标志物分析中，肿瘤标志同工酶可分为三大类型：异位型同工酶：指某种瘤组织改变了自己的分泌特性，而去分泌表达了其它成年组织的同工酶的类型；胚胎型同工酶：某些组织在肿瘤状态时，使酶的同工酶谱退化到胚胎时未分化状态，而分泌出大量的胚胎期的同工酶，这种变化往往与肿瘤的恶性程度成正比；胎盘型同工酶：有些肿瘤组织会分泌出某些原属胎盘阶段的同工酶谱。,（一）前列腺特异性抗原（PSA） PSA是1979由Wang等从前列腺组织中分离出来的丝氨酸蛋白酶，分子量34ku，PSA仅存在于前列腺上皮组织和精液内，具有糜蛋白酶样和胰蛋白酶的活性，PSA具有高度的组织特异性。 【参考范围】男性：2.5g/L（RIA法、ElA法）。,【临床意义】 PSA是前列腺癌的特异性标志物，也是目前少数器官特异性肿瘤标志物之一。前列腺癌是男性泌尿系统的主要囊性肿瘤，前列腺癌患者血清PSA明显增高，放疗后疗效显著者，50%以上2个月内血清PSA降至正常。故PSA测定可作为监测前列腺癌病情变化和疗效的重要指标。,（二）前列腺酸性磷酸酶（PAP） PAP是前列腺分泌的一种含有两条肽链的糖蛋白酶，分子量102ku，含糖量13%。在pH5.0的酸性环境中活性最强，能水解各种有机磷酸酯。 【参考范围】4U/L（RIA、ELISA法） 【临床意义】 测定PAP诊断前列腺癌的特异性比PSA高，可达96%。但灵敏度较PSA低，PAP和PSA联合使用可提高诊断的阳性率。,（三）神经原特异性烯醇化酶（NSE） 烯醇化酶是催化糖原酵解途径的酶。由3个不同的亚基、，组成5种二聚体形式的同工酶、。亚基同工酶存在于神经原和神经内分泌组织，称为NSE。NSE的分子量为78ku 。细胞癌变时，细胞增殖周期加快，细胞内的NSE释放入血增多。 【参考范围】0.6-5.4g/L。,【临床意义】 NSE是神经母细胞瘤和小细胞肺癌的标记物。NSE作为神经母细胞瘤的标志物，对该病的早期诊断具有较高的临床应用价值。小细胞肺癌（SCLC）是一种恶性程度高的神经内分泌系统肿瘤，约占肺癌的25%30%，它可表现神经内分泌细胞的特性，有过量的NSE表达，比其它肺癌和正常对照高5-10倍以上。SCLC患者血清NSE检出的阳性率可高达65%-100%，目前已公认为NSE可作为SCLC高特异性、高灵敏性的肿瘤标志物。,（四）-L岩藻糖苷酶（AFU） AFU是存在于血清中的一种溶酶体酸性水解酶，分子量230ku，广泛分布于人体组织细胞、血液和体液中。 【参考范围】32490mol/L（化学法）。 【临床意义】AFU是原发性肝癌的一种新的诊断标志物，广泛分布于人体组织细胞、血液和体液中，原发性肝癌患者血清AFU活力显著高于其它各类疾患。,目前，AFU升高的机制不甚明了，可能有以下几种原因： 1. 肝细胞和肿瘤细胞的坏死使溶酶体大量释放入血； 2. 正常肝细胞的变性坏死可使摄取和清除糖苷酶的功能下降； 3. 肿瘤细胞合成糖苷酶的功能亢进； 4. 肿瘤细胞可能分泌某种抑制因子，抑制肝细胞对糖苷酶的清除能力或释放某些刺激因子，促进肝细胞或肿瘤细胞本身合成糖苷酶。,四、激素类抗原标志物的测定 当具有分泌激素功能的细胞癌变时，就会使所分泌的激素量发生异常。这称为正位激素异常。而在正常情况下不能生成激素的那些细胞，转化为肿瘤细胞后所产生的激素，或者是那些能产出激素的细胞癌变后，分泌出其它分泌细胞所产生的激素。称为异位激素。,激素类肿瘤标志物,（一）人绒毛膜促性腺激素（HCG） HCG是由胎盘滋养层细胞所分泌的一类糖蛋白类激素，在正常妊娠妇女血中可以测出HCG。HCG有、两个亚基，-亚基的分子量约为13000，-亚基的生物特性与卵泡刺激素（FSH）和黄体生成激素（LH）的-亚基相同。-亚基的分子量约15000，-亚基为特异性链，可被单克隆抗体检测，也是一个较好的标志物。,（二）降钙素（CT） CT是由甲状腺滤泡C细胞分泌的一种多肽激素，分子量3.5ku。 【参考范围】100ng/L 【临床意义】CT是甲状腺髓样癌的肿瘤标志物。肺癌、乳腺癌、胃肠道癌及嗜铬细胞瘤病人可因高血钙或异位分泌使血清CT增高。,（三）儿茶酚胺类及其衍生物 儿茶酚胺类激素是由肾上腺髓质中的一些交感神经节纤维末梢终止髓质细胞（又称嗜铬细胞）产生和分泌，包括肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）和多巴胺（DA）等，它们既是激素又是神经递质。,1.变肾上腺素 变肾上腺素是儿茶酚胺的甲基化代谢产物，甲基化是在肝细胞微粒体中进行，而儿茶酚胺的形成是在肾上腺髓质的嗜铬细胞及交感神经末梢处形成。 【参考范围】0.30-1.50mol/24h尿。变肾上腺素浓度增高是分泌型嗜铬细胞瘤的主要标志物。,2.香草扁桃酸（3-甲氧-4羟苦杏仁酸，VMA） 是肾上腺素和去甲肾上腺素经单胺氧化酶（MAO）和儿茶酚胺-O-甲基转移酶（COMT）的作用下，甲基化和脱氨基的降解产物。VMA主要是从尿中排出。 【参考范围】成人5.0-35.0mol/24h 尿。,【临床意义】常被认为是神经母细胞瘤、神经节瘤和嗜铬细胞瘤的标志物。约有70神经母细胞瘤患者均有VMA增高，在儿童的神经母细胞瘤患者中，VMA也是一项重要指标。 VMA又可作为嗜铬细胞瘤的诊断首选标志物，但有时增高程度不稳定，宜同时测定尿中儿茶酚胺和变肾上腺素。,五、基因类标志物的测定 随着分子生物学的理论和技术的发展，癌基因和抑癌基因的检测已成为肿瘤临床诊断新一代的标志物。 （一）癌基因类肿瘤标志物 癌基因或肿瘤基因是指在自然或实验条件下，具有潜在的诱导细胞恶性转化的基因。从目前的资料分析，引起细胞恶变功能的基因已达30余种。,常见癌基因类肿瘤标志物,1.ras基因家族及其表达产物 ras基因表达产物是由188个或189个氨基酸组成的21ku蛋白质，故ras基因编码产物为p21ras蛋白。其本质为G蛋白，具有GTP酶活性，可水解GTP生成GDP。 当机体发生肿瘤时，编码p21ras蛋白的第12、13及61位氨基酸的核苷酸可以发生点突变，突变型的p21ras蛋白不具有GTP酶活化，无法使GTP水解为GDP。另外尚可在肿瘤中发现p21ras蛋白表达过度。,ras基因检测的方法 （1）PCR-SSCP（单链构象多态性）、DGGE（变性梯度凝胶电泳，）、PCR-ASO（等位基因特异性寡核苷酸杂交，）和测序技术：探测点突变。 （2）免疫组织化学：用RAP-5单抗。 （3）Southern印迹法及Northern印迹法。 （4）ELISA法及Western印迹法。,ras基因家族与肿瘤的关系,2.myc基因家族及其表达产物 1997年Duesbery等发现myc癌基因与禽类MC29病毒具有相似性。Myc基因家族共有6成员：C-myc、N-myc、L-myc、P-myc、R-myc及B-myc。其中C-myc、N-myc及L-myc与一些人类肿瘤相关。当机体发生肿瘤时，myc基因家族成员可以发生染色体基因易位、基因扩增以及表达过度。,myc基因检测的方法 （1）标准细胞核型分析：基因易位。 （2）原位杂交：ELISA法。 （3）Southern印迹法及Northern印迹法。 （4）RT-PCR方法。,myc基因家族成员与肿瘤的关系,（二）抑癌基因 机体中有一类对正常细胞增殖起负调节作用的基因称为抑癌基因。当这类基因丢失、失活或变异时，往往会促使细胞失控而呈恶性生长。,常见抑癌基因类肿瘤标志物,1.RB基因及其表达产物 1986年Friend等成功地克隆了RB基因。RB基因定位于第13号染色体的13q14区，共有27个外显子，26个内含子，DNA长度约200kb。其编码的蛋白质产物为p110。 当机体发生肿瘤时，RB基因的主要变化形式有：缺失、突变、甲基化、表达失活及与病毒和细胞癌蛋白结合引起功能性失活。,RB基因检测的方法 （1）PCR-SSCP、DGGE、PCR-ASO及测序技术：检测点突变。 （2）PR-PCR、PCR。 （3）PCR-RFLP限制片段长度多态性。 RB基因与肿瘤的关系 （1）RB基因突变约见于40的视网膜母细胞瘤。 （2）RB基因还与成骨细胞肉瘤、软组织肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、卵巢癌及膀胱癌有关,2.p53基因及其产物 1981年Crawford等发现了p53基因，并认为其为癌基因。以后Hinds、Finlay等通过研究发现传染了myc或ras癌基因的细胞中，若存在野生型p53基因，则出现生长抑制。因此提出p53基因属于抑癌基因。,P53基因定位于第17号染色体17p13区，由11个外显子和10个内含子组成，编码393个氨基酸残基的蛋白质即p53蛋白。p53的功能为转录因子，生物学功能为G1期DNA损坏的检查点。人类肿瘤中P53基因突变主要在高度保守区内，以175、248、249、273、282位点突变率最高，不同种类肿瘤其突变类型不同。 p53基因检测的方法：同RB基因检测方法。,p53基因与肿瘤的关系,六、其它 其他肿瘤标志物，如蛋白质肿瘤标志是最早发现的标志物。一般来讲这类标志物特异性