2017毕业论文-敬钊毒素-XI（JZTX-XI）及其突变体M5A-JZTX-XI的固相合成与复性.doc

目 录摘要IAbstractII1 前言11.1 蜘蛛毒素的组成11.1.1 蜘蛛毒素的蛋白质类成分11.1.2 蜘蛛毒素的多肽类成分21.2 多肽类蜘蛛毒素的研究现状21.2.1 作用于电压门控钠离子通道毒素31.2.2 作用于电压门控钾离子通道毒素41.2.3 作用于电压门控钙离子通道毒素41.3 已研究的敬钊毒素概况61.4 JZTX-XI的研究状况81.5 固相合成的优缺点101.6 固相合成的研究发展前景112 实验部分122.1 固相合成的基本原理122.1.1 树脂的选择和氨基酸的固定122.1.2 氨基、羧基、侧链的保护和去除132.1.3 缩合反应与裂解132.2 实验试剂与仪器142.3 实验方法142.3.1 多肽的仪器合成与裂解142.3.2 多肽的分离纯化与质谱鉴定152.3.3 合成肽的复性摸索152.3.4 JZTX-XI 突变体M5A-JZTX-XI的合成、复性和分离纯化163 结果与讨论173.1 JZTX-XI的固相合成结果173.2 JZTX-XI的氧化复性结果193.3 M5A-JZTX-XI的合成和复性结果203.3.1 合成的M5A-JZTX-XI反相HPLC和质谱203.3.2 复性223.4 影响多肽固相化学合成条件的讨论243.4.1 合成的环境和试剂要求243.4.2 氨基酸侧链基团对合成的影响253.4.3 固相肽合成仪的影响253.4.4 树脂和催化剂的影响253.4.5 裂解时间的影响263.5 影响合成多肽的氧化复性条件的讨论26参考文献27致 谢29化学化工学院2010届本科毕业论文敬钊毒素-XI（JZTX-XI）及其突变体M5A-JZTX-XI的固相合成与复性摘要：敬钊毒素-XI(JZTX-XI)是从敬钊缨毛蛛(Chilobrachys jingzhao)粗毒中分离纯化到的一种新型的肽类神经毒素，由34个氨基酸残基组成，其中6个半胱氨酸形成3对二硫键，其一级结构为：ECRKMFGGCSVDSDCCAHLGCKPTLKYCAWDGTF。为了研究JZTX-XI结构与功能的关系，用芴甲氧羰基(Fomc)固相多肽合成方法仪器合成了天然JZTX-XI和突变体M5A-JZTX-XI，并通过反相HPLC和质谱对不同条件下的氧化复性结果进行监测，从而得到合成多肽的最佳氧化复性条件为：pH为8的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液、1.0 mmol/L 的GSH、0.1 mmol/L 的GSSG，样品质量浓度为0.01 g/L，温度为4,时间为24 h。复性产物经质谱测定其相分子质量与理论分子质量相符。关键词：JZTX-XI；固相多肽合成；突变体；反相HPLC；氧化复性Synthesis and Folding of M5A-JZTX-XI：a Mutant of Jingzhaotoxin-XIAbstract： Jingzhaotoxin-XI (JZTX-XI) is a novel peptide neurotoxin isolated from the venom of the spider Chilobrachys jingzhao. It is composed of 34 residues with three disulfide bonds. The primary structure of JZTX-XI is ECRKMFGGCSVDSDCCAHLGCKPT LKYCAWDGTF.In order to investigate the structure-function relationship of JZTX-XI, the natural JZTX-XI and mutant M5A-JZTX-XI were synthesized by solid-phase chemistry method with Fmoc-protected amino acids on the PS3 automated peptide synthesizer. Reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and matrix assisted laser desorptionion ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF MS) were used to monitor the oxidative refolding of synthetic linear peptides to find the optimal renaturation conditions of toxins. When samples (0.01 g/L) were dissolved in 0.1 mol/L Tris-HCl buffer containing 1.0 mmol/L reduced glutathion (GSH) and 0.1 mmol/L oxidized glutathion (GSSG) at pH 8.0 and, 4，the best time is 24 h. the best renaturation yields of synthetic peptides were obtained. The experiments also proved that the relative molecular masses of renatured peptides were in accordance with their theoretical molecular masses.Key words： JZTX-XI; solid-phase synthesis; mutant; MALDI-TOF; oxidative foldingII1 前言 多肽是涉及生物体内各种细胞实现生理功能的重要物质，对于多肽的研究，当今世界已经出现了一个空前的繁荣景象。多肽的合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽合成，可以解决科研过程中许多棘手的问题：多肽合成可以验证一个新的多肽的结构；用于研究结构与功能的关系；设计新的多肽；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；改造多肽分子；合成新的多肽药物等。 多肽的化学合成技术的发展近些年来迅猛发展。而近几十年来，固相法合成多肽以它省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽类合成的最常用的方法。1.1 蜘蛛毒素的组成人们一般把蜘蛛毒素分子分为三大类：第一类是分子量1 kDa以下的小分子物质。第二类也是含量最丰富的一类，为分子量1到10 kDa之间的多肽类毒素。第三类是分子量10 kDa以上的蛋白质类。毒素中的小分子物质有很多种，以前的研究探明，蜘蛛毒素中的小分子物质主要有无机盐类（Na+、K+、Ca2+、Cl-）、氨基酸、核苷酸、有机碱、多胺类物质和神经递质（如多巴、GABA、肾上腺素）等1。目前，很多小分子物质的作用和意义还不清楚，有人认为小分子物质可能会加强毒素对猎物的伤害，还有人认为只是一些降解产物。在对小分子物质的研究中，对多胺类物质的研究已经呈现一个新的领域。Gerard P. Ahern等人认为一些多胺类是潜在的辣椒素受体2。日本发现的多胺类小分子JSTX-33能阻断突触后膜的谷氨酸受体。通过对越来越多的多胺类物质结构的解析，发现多胺类的毒素都有一些共同的特点，分子头部通常是一个苯酚基团或是一个吲哚基团，分子尾部通常是一个胺基或是一个胍基，中间是多胺构成的主链4（见图1-1）。通过对多胺类的了解深入，人们开始意识到它们可以成为选择性作用于离子通道的工具试剂，在医药和科研上发挥更大的作用。1.1.1 蜘蛛毒素的蛋白质类成分蜘蛛蛋白质类成分富含多种活性酶，血蓝蛋白，未知蛋白，以及少量的毒素蛋白。酶类主要包括：能量代谢相关酶类，如ATP合成酶、NADH脱氢酶、ATP-NAD激酶、乙酰辅酶A氧化酶、谷胱甘肽转移酶等；消化相关酶类，如淀粉酶等；脂类代谢相关酶类，如磷脂酶A1、阿朴脂蛋白酶等；其它酶类，如过氧化物酶、转移酶等。图1-1 蜘蛛毒液中多胺类常见结构血蓝蛋白又称血清素，是存在于某些软体动物和节肢动物中的一种游离的蓝色呼吸色素5。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，它易与氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。它是在某些软体动物、节肢动物（甲壳虫和蜘蛛）的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白有多种催化作用，特别是变性后，在特定条件下具有多酚氧化酶、过氧化氢酶和脂氧化酶等活性6。毒素相关蛋白中以黑寡妇蜘蛛中发现的Latrotoxins（LTX）7最著名。它可以通过三种方式作用于细胞膜：一是它能通过钙离子依赖的方式结合突触前膜外生蛋白，激活某种信号通路，从而释放突触小泡；二是它在其作用的细胞膜形成在一种非特异性的孔道，使其允许钙离子和一些谷氨酸、乙酰胆碱等小分子量物质通过，进而引起对靶细胞的伤害；三是它可以与G蛋白藕联受体结合，并通过G蛋白信号通路促使突触小泡大量释放神经递质8。1.1.2 蜘蛛毒素的多肽类成分蜘蛛毒液中含量最丰富也是研究最多最深入的一类就是分子量在1000到10000 Da的多肽类成分，一般含有3对或是4对的二硫键。目前已有成百上千种蜘蛛多肽毒素被研究，它们的主要生物学功能是能够作用于靶体细胞膜上的各种离子通道，从而实现捕食猎物和防御天敌的目的。1.2 多肽类蜘蛛毒素的研究现状通过对多肽组学的研究，在任意两种蜘蛛中没有发现有同一分子量和相同序列的多肽，也没有在任意两种蜘蛛毒液中通过基质辅助激光解析离子飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）发现到相同分子量的肽段。蜘蛛多肽毒素呈现出多样性，但是大多数的多肽类毒素却主要集中在1到6 kDa。以中国虎纹捕鸟蛛为例，其多肽毒素主要集中在3到6 kDa9。根据多肽毒素的生物学功能主要可以分为三大类：一是作用于靶细胞膜上的各种离子通道，通过堵塞或强化离子流来使猎物或天敌麻痹甚至死亡。一般的多肽通常会作用于多种不同类型的离子通道，如敬钊蜘蛛毒素-V能作用Nav1.8和Kv4.310。二是作用于神经递质受体，如芋螺毒素-GI能抑制乙酰胆碱与受体竞争性结合。三是作用于酶的相关机制，如虎蛇可以分泌强烈的凝固剂、溶血素，被虎蛇咬后，除了伤口剧痛之外，从伤口附近延伸的毒素更会令足部及颈部出现痛楚，身体感到麻痹、出汗，随即开始呼吸困难及局部肢体瘫痪。而蜘蛛毒素按照功能和作用又可以分为神经毒、坏死毒和混合毒三种，其中神经毒素占三分之二以上11。蜘蛛毒素的毒素作用是通过毒素分子与靶体细胞受体的相互作用完成的，尤其是通过各种离子通道来完成的。毒素的三维核磁共振解析和蛋白结晶的X-衍射证明了蜘蛛的多肽毒素大部分是门控修饰而不是直接堵塞门孔的方式来作用于离子通道的12-13。在三维结构图上，毒素分子表面大量的疏水性的氨基酸残基所形成的疏水斑片，其周围又分布着一些带电荷氨基酸残基，这种特殊结构能与离子通道上的电压敏感元件相互作用，影响电压敏感元件的移动，从而影响离子通道的电流。1.2.1 作用于电压门控钠离子通道毒素电压门控钠通道（voltage-gated sodium channels，VGSCs）是指在去极化电压诱导下才能被激活的钠通道。许多天然的钠通道毒素，大多数都是电压门控型毒素。VGSCs广泛存在于中央与外周神经系统的神经元、肌肉以及各种可兴奋性细胞中，在各种神经元的兴奋中发挥着关键作用。电压门控钠离子通道毒素能有目的性地选择和钠通道亚基的不同部位结合，而引起通道的动力学特征发生改变，如易化激活、阻塞通道口、慢失活、通道去失活14等。这些毒素的化学本质都为多肽类或有机小分子类钠通道毒素。其中，多肽类钠通道毒素具有专一性强、活性高等优点。在目前的研究中，在哺乳动物神经元钠通道上已经有六个部位能与上百种的毒素分子相结合。这些位点分布于细胞膜外侧、通道孔内和跨膜区域上。这些电压门控钠通道部位依次被命名为位点1-位点6（Sitel-Site6），而结合于这些位点的毒素则相应分别称之为位点1毒素（Site 1 toxin）-位点6 毒素（site 6 toxin）。电压门控钠通道根据是否能被河豚毒素（TTX）阻断，又可分为两大类：河豚毒素敏感型钠通道（TTX-sensitive，TTX-S）和河豚毒素不敏感型钠通道（TTX-resistant，TTX-R）15-19。表1-1是一些作用于钠离子通道的蜘蛛毒素。表1-1 作用于钠离子通道的部分蜘蛛毒素Peptide spider Amino acid sequnce aa TargetMagi5 Macrothele gigas GCLKTFWKCKNKKECC 29 Nav1.2 GWNACALGICMPR ProTxII Thrixopelma pruriens YCQKWMWTCDSERKC 29 Nav1.8CEGMVCRLWCKKKWHainantoxin-I Selenocosmia hainana ECKGFGKSCVPGKNEC 33 Nav1.2CSGYACNSRDKWCKVLLHainantoxin-III Selenocosmia hainana GCKGFGDSCTPGKNECCP 33 TTX-SNYACSSKHKWCKVY1.2.2 作用于电压门控钾离子通道毒素钾离子通道（voltage-gated potassium channels，VGPCs）相对其它离子通道研究得最早，也最为通彻。电压门控性钾离子通道在调节静息电位、细胞膜的复极化等重要的细胞生理过程有着重要的作用。钾离子通道结构域相对简单，它主要是由两型功能域组成的：即由S5至S6跨膜螺旋片段通过四聚排列构成的中央孔域和由S1至S4跨膜螺旋片段构成的电压敏感域。电压门控钾通道也可分为三种类型：外向延迟整流钾通道（Kr），瞬时外向钾通道（KA），内向整流钾通道（Kir）。目前在蜘蛛中发现的钾离子通道抑制剂主要作用在Kv2（shab-related K+ channels）和Kv4（shab-related K+ channels）。例如，最早从蜘蛛毒液中分离的hanatoxin-I（HaTx1）20是一种可以抑制钾离子通道多肽毒素，它由35个氨基酸残基折叠成抑制剂胱氨酸结构模体（ICK motif）。它对Kv2.1钾离子通道表现出很高的亲和性，而对Kv1、Kv3钾离子通道没有作用，对于Kv4只有较弱的抑制作用。目前hanatoxin-I是研究Kv2.1离子通道的一个常用试剂。hanatoxin-I能够结合电压敏感元件S3b-S4的跨膜螺旋所形成的电压敏感浆叶结构，并形成稳态复合体，它的持续作用时间比电压敏感元件从负电位时的静息状态转变成正电位时的活化开放状态的时间要长得多。通过定点突变技术证实了Kv2.1离子通道的I273、F274和E277很有可能是hanatoxin-I 的结合位点。表1-2是一些作用于钾离子通道的蜘蛛毒素。 1.2.3 作用于电压门控钙离子通道毒素 电压门控钙离子通道（voltage-gated calcium channels，VGCCs）可根据其电生理和电压依赖性可分为高电压门控性（HVA）和低电压门控性（LVA）。其中LVA VGCCs只需要较小的去极化就能激活通道。并且失活也快，因此它又被称为瞬时VGCCs（T-型）。相反，HVA VGCCs需要较强的去极化才能激活，其单通道的电导相对较大。根据其药学理特征，高电压门控性钙离子通道又可以分为四种亚型：L-型，它是在心肌和骨骼肌细胞发现的一种钙离子通道，能被双氢吡啶类药物特异性抑制，其特征是电流电导较大且失活很慢；N-型，它是后来在感觉神经元细胞上发现的不能对双氢吡啶类药物特异性抑的，它的单通道电导介于L-型和T-型之间，失活快于L-型。表1-2 作用于钾离子通道的部分蜘蛛毒素Peptide spider Amino acid sequnce aa TargetPaTx1 Phrixotrichus auratus YCQKWMWTCDSARKCCE 29 Kv4.2，Kv4.3 GLVCRLWCKKIIHaTx1 Grammostola spatula ECRYLFGGCKTTSDCCKHLG 35 Kv4.2,Kv4.3 CKFRDKYCAWDFTFSSGTx1 Stromatopelmacalceata TCRYLFGGCKTTADCCKHLA 34 Kv2.1 CRSDGKYCAWDGTF HpTx1 Heteropoda venatoria DCGTIWHYCGTDQSECCEGW 33 Kv4.2 KCSRQLCKYVIDW芋螺毒素-conotoxin GVIA能专一阻断N-型钙电流；P-型，它是神经元上存在的对于双氢吡啶类药物和芋螺毒素-conotoxin GVIA都不能阻断，但是能被美洲漏斗网蛛毒素-agatoxin GVIA抑制的钙电流。在较高浓度下-agatoxin GVIA还能够继续抑制的定名为Q-型；在很多神经元中，使用三种抑制剂还不能抑制所有的HVA电流，叫做R-型。昆虫的各类型VGCCs广泛分布在脑和神经组织、中枢神经的胞体、树突近端、神经末梢、毛细胞、树突干、嗅觉感受器等，对生物体的感觉、细胞增殖、凋亡等生理功能发挥着重要作用。开展该类通道蛋白的抑制剂和激活剂的研究具有重要生物学意义，具有广阔的应用前景。常用的钙通道拮抗剂（calcium channel blocker， CCB）对治疗心绞痛、高血压、心律失常等心血管疾病和对保护心肌缺血再灌注损伤作用，以及对治疗哮喘、抗动脉粥样硬化、改善组织血流、抗炎、逆转抗肿瘤药物的多药耐药性、治疗癫痫等都取得了较好的治疗效果。钙通道拮抗剂是高血压治疗中一类非常重要的药物，我国有一半以上服药治疗的高血压患者都使用钙离子拮抗剂。国际上的重要临床研究显示，亚洲患者对钙离子拮抗剂更敏感，也更容易坚持治疗。另外，从澳大利亚漏斗网蛛中分离到的-atracotoxin毒素系列，能选择性地作用于昆虫的钙离子通道，有成为杀虫剂的良好前景。目前已知的作用于钙离子通道的部分蜘蛛毒素见表1-3。1.3 已研究的敬钊毒素概况 敬钊缨毛蛛（Chilobrachys jingzhao）是我国海南省琼中县发现的蜘蛛新种。从2002年起，廖智等人从毒素学的角度对敬钊蜘蛛毒素进行系统研究。他们从敬钊蜘蛛毒素的多肽成分中，提取60种多肽进行了序列测定。其中有31条多肽测定了全序列，另外29条测得了N端部分序列。通过质谱分析发现，在测得全序列的31个多肽分子中，29条多肽含有6个半胱氨酸，形成3对二硫键。另外两个多肽则含有8个半胱氨酸，形成4对二硫键。在这31条多肽中，其中有11个存在C端酰胺化修饰。后来陈金军等人通过转录组学的方法在敬钊缨毛蛛毒腺中发现了104个富含二硫键的毒素序列和115个细胞功能相关蛋白。通过转录组与多肽组的数据比较，其中有34个毒素是都能鉴定到的。其它一些毒素不能在两个库中同时存在的原因可能有：两种方法的取材不同。毒素组取材是同种蜘蛛的混合毒素，而转录组的蜘蛛毒腺取材于基本上是年龄和状态相近的八只蜘蛛。核酸和蛋白质检测的方法不同。蜘蛛毒液中至少含有200多个多肽毒素，目前利用传统的分离方法，只能得到一些丰度较高的多肽，相当多的丰度偏低的多肽在分离和纯化的过程中会损失殆尽。而核酸可以复制，根据cDNA文库的结果，可以发现更多的毒素的序列数目和更多低丰度蛋白的信息。此外，在敬钊缨毛蛛毒液中还发现了与嘌呤、多胺、烟酰胺代谢相关的酶。表1- 3 作用于钙离子通道的部分蜘蛛毒素Peptide spider Amino acid sequnce aa Targethuwentoxin1 Ornithoctonus ACKGVFDACTPGKNECCPNRVCSD 33 N-typehuwena KHKWCKWKL GSTxSIA Grammostola DCVRFWGKCSQTSDCCPHLACKSK 36 P/Q andSpatula WPRNICVWDGSV N-type -PTxIIA Phoneutria SCINVGDFCDGKKDDCQCCRDNAFCSCSVIFGYK nigriventer TNCRCEVGTTATSYGICMAKHKCGRQTTCTKPCL 76 R-type SKRCKKNH- AgaIVA Agelenopsis KKKCIAKDYGRCKWGGTPCCRGRGCICSIMGTN 48 P-type aperta CECKPRLIMEGLGLASNX-325 Segestria GSCIESGKCTHSRSMKNGLCCPKSRCNCRQIQHR 49 N-type Florentina HDYLGKRKYSCRCS在敬钊缨毛蛛毒素中，分子量小于10 kDa的多肽成分占到总成分的70%。其中又有超过120种不同分子量的多肽主要集中在3到5 kDa之间。在敬钊缨毛蛛中富含各种可结合各种类型的电压门控离子通道的毒素，而背根神经节（DRG）的细胞膜上的离子通道类型非常丰富，所以有报道对敬钊缨毛蛛毒素在大鼠DRG细胞上的活性做过膜片钳电生理分析，结果却发现在大鼠DRG细胞上找到活性的毒素只占小部分。因此，这大部分在DRG细胞上没检测到活性的毒素，有待通过其它的方法来研究其功能，同时也说明了蜘蛛毒素的功能多样性。目前已研究的敬钊蜘蛛毒素在大鼠DRG细胞上的离子通道活性统计见图1-2。经过对敬钊缨毛蛛多肽毒素约十年的研究，敬钊蜘蛛的各种毒素对电压敏感型的钠、钾通道表现出不同的生理活性，呈现出良好的药用前景，见表1-4。如敬钊毒素-V（JZTX-V）就是一种新型的肽类神经毒素，根据MALDI-TOF质谱图1-2 15种多肽毒素在大鼠DRG细胞上各离子通道的作用鉴定和Edman降解测序结果表明：它的相对分子质量为3605.73 Da，由29个氨基酸残基组成，有6个半胱胺酸且形成3对二硫键。膜片钳电生理实验表明，JZTX-V能够有效地抑制大鼠背根神经节（DRG）细胞上的河豚毒素不敏感型（TTX-R）与河豚毒素敏感型（TTX-S）钠电流，它的半数有效抑制浓度（IC50）值分别为27.6 nmol/L和30.2 nmol/L。而特异表达于外周感觉神经元上的TTX-S钠通道亚型Nav1.7与TTX-R钠通道亚型Nav1.8和Nav1.9都是治疗疼痛的理想作用靶点。鉴于河豚毒素不敏感型钠通道亚型包括Nav1.8与Nav1.921和敏感型钠通道亚型Nav1.7都只在外周感觉神经元中才能表达，而且抑制此类通道能够产生明显的镇痛效果，却没有类似目前临床镇痛药物的毒副作用，因此，JZTX-V具有取代有成瘾性的吗啡，开发成新型镇痛药物的应用前景。如果JZTX-V通过适当的分子改造，加强其镇痛活性而去除有弊活性，JZTX-V将非常有希望开发成毒副作用小的一类新型镇痛药物。表1-4 已研究的部分敬钊蜘蛛毒素情况Peptide Amino acid sequnce aa TargetJZTX-I ACGQFWWKCGEGKPPCCANFACKIGL 33 Kv2.1，Kv4.1，Kv4.2YLCIWSP Nav1.5JZTX-II GCGTMWSPCSTEKPCCDNFSCQPAIK 32 selectivity for mammalian WCIWSP VGSC subtypes JZTX-III DGECGGFWWKCGRGKPPCCKGYACS 36 Kv2.1，Nav1.5 KTWGWCAVEAP JZTX-IV ECTKFLGGCSEDSECCPHLGCKDVLY 34 Na+ channels in DRGYCAWDGTF JZTX-V YCQKWMWTCDSKRACCEGLRCK 29 Kv2.1，Kv4.1，Kv4.2LWCRKII Na+ channels in DRGJZTX-XII YCQKWMWTCDSERKCCEGYVCEL 29 Kv4.1 WCKYNL JZTX-XIII ECRWLFGGCEKDSDCCEHLGCRRA 35 Kv2.1，Kv4.1，Kv4.2 KPSWCGWDFTV 1.4 JZTX-XI的研究状况JZTX-XI也是从敬钊缨毛蛛毒液中分离到的一种多肽毒素，通过N-端Edman降解法对其测序，发现JZTX-XI是由34个氨基酸残基组成，其中包含有6个半胱氨酸。它与钾通道毒素Stromatoxin-1、Hanatoxin-1和Heteroscodratoxin-1有超过70%的同源性，与钠通道毒素Toxin CcoTx3和钙通道毒素SNX-482有大约60%的同源性（图1-3 A）。JZTX-XI的cDNA序列有468个碱基对，由3非翻译序列，5非翻译序列和编码前体分子的开放阅读框构成。JZTX-XI的开放阅读框编码86个氨基酸残基组成JZTX-XI前体。JZTX-XI的成熟肽（34个氨基酸残基）前含一段信号肽区（21个氨基酸残基），以及一个Pro区（29个氨基酸残基），另外还有两个额外的残基（-GK），而这额外的残基能影响多肽的翻译后修饰，它们往往是多肽毒素C-末端酰胺化的信号。（图1-3 B）活性表面一般由两部分构成：一是中心部分也是最重要的部分，通常包含了一些关键的氨基酸残基，如带电荷的残基、疏水性残基等，它们通过静电作用、疏水作用、氢键等非共价键与靶蛋白的残基结合；二是外周部分，它们通过与靶蛋白上相应的残基靠近，可以有效地将水分子排除在作用面之外，从而形成一个疏水的环境，有利于关键残基间的作用。通过核磁共振技术的结构解析，发现JZTX-XI的N端和C端，以及部分带电荷残基和疏水性残基的溶液可及性表面面积都在其氨基酸总面积的30%以上。6个Cys，Leu19，Gly20和Ala29九个残基组成一个疏水性的核心位于空间结构的内部，它的溶液可及性表面小于10%（图1-4 A）。JZTX-XI的6个Cys形成的三对二硫键，为1-4，2-5，3-6连接，三对二硫键形成的节状结构对稳定分子的空间结构有非常重要的作用。它的这种分子结构属于典型的ICK模体结构。图1-3 JZTX-XI的氨基酸序列及cDNA序列 A：JZTX-XI与其它具有高序列相似性的多肽序列比较B：JZTX-XI的cDNA序列，成熟肽下面选线表示，C端-GK为酰胺化信号JZTX-XI对于表达于爪蟾卵母细胞的Kv2.1通道的抑制具有浓度依赖性的特征。在-30 mV到-20 mV的去极化情况下测定JZTX-XI对Kv2.1通道抑制的Kd值为0.74 M22。与其它毒素的空间结构比较，JZTX-XI的序列与hanatoxin1、SGTx1有较大的相似性，而且它们对于Kv2.1通道有相似的抑制模式。三种毒素的结构比较如图（1-4B）。如图可见，这三种毒素均是ICK结构模体，空间走向也大概相似，其表面结构均有一个由疏水性氨基酸残基构成的突出于分子表面的斑片状结构，而带电荷的残基则围绕着该斑片结构。根据上述两种毒素空间结构和功能方面与JZTX-XI的对比，估计JZTX-XI与Kv2.1通道结合的关键残基可能是M5，F6，W30，R3和K22。JZTX-XI还具有抑制急性分离的大鼠心肌钠通道电流的作用，IC50值为1.28 M。Hanatoxin1和SGTx1均未发现有钠通道抑制活性，这可能是JZTX-XI的N端分布有R3、K4、D12和D14这几个带电荷的残基。这几个带电荷的残基在空间分布上与-ACTX-Hv1a和-ACTX-Ar1a（两种钠通道毒素）具有拓扑学上的相似性23。大鼠心肌钠通道主要是Nav1.5通道，故与Nav1.5通道结合的关键残基可能是R3、K4、D12和D14。 图1-4 JZTX-XI、hanatoxin1和SGTx1三种毒素分子表面带电荷残基及疏水性残基分布 A：JZTX-XI突出于分子表面的带电荷残基和疏水性残基分布B：JZTX-XI、hanatoxin1和SGTx1表面结构的比较1.5 固相合成的优缺点 固相合成法对于多肽合成有显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；反应可在一简单反应器皿中进行，避免了因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链可通过快速的抽滤、洗涤来完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，也避免中间体分离纯化时造成的损失；使用过量反应物，促使化学平衡要生成物方向进行，以便最终产物得到高产率；固相载体上肽链与聚合链紧密相混，彼此产生一种溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利却对反应适宜。固相合成的主要存在问题是容易产生中间体杂肽而造成分离不纯，最终产物的纯度不如液相合成物；成本相对较高，使得多肽类物质的研究和应用受到限制。 1.6 固相合成的研究发展前景 固相多肽合成接近五十年的历史了，然而到现在，人们还只能合成一些较短的肽链，更谈不上随心所欲地合成蛋白质了，同时合成中的试剂毒性大、费用昂贵和副产物多等一直都是令人头痛的问题。最近，南开大学孙怀林教授领导的科研小组不是以氨基酸为原料，而是用容易得到的亚胺和一氧化碳为单体，在特殊的催化剂作用下发生交替共聚直接生成多肽，填补了国内外“不用氨基酸作原料合成多肽方法”的空白，带来了多肽合成一场新的革命。292 实验部分2.1 固相合成的基本原理 多肽固相合成法，是由美国著名生物化学家 Merrifield 于1963 年发明的。这一重大发明，对于毒素这些多肽类物质的研究具有划时代意义。与传统的多肽液相合成法相比，具有如下优越性：只需经过过滤和冲洗，就可以将产物多肽从可溶性试剂中分离开来；易于计算机自动化控制；使用过量的反应试剂促使反应平衡向生成物方向的彻底进行；反应产物多肽一直结合在固相载体上，损失量将达到最小。因此固相多肽合成带来了多肽有机合成上的一次革命，为此，Merrifield获得了1984年的诺贝尔化学奖。后来，Carpino 在前人基础上进行了改进并发明了Fmoc多肽固相合成方法。Fmoc合成法具有反应条件温和，副反应少，反应过程易于控制等优点。现在生化领域很多构建多肽突变体的工作都是通过Fmoc多肽固相合成的方法得到的。多肽合成一般都是从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成，先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的形式同一个不溶性的载体（通常是高分子树脂）相连，然后以结合在固相载体上的氨基部分经过去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合洗涤去保护洗涤下一轮缩合）操作，直到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上用裂解液裂解下来，经过沉淀、液相分离等手段，得到最终所要的多肽。其中-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，目前普遍使用的是-氨基用Fmoc（9-芴甲氧羰基）保护的Fmoc固相合成法。本实验也是采用的后者方法。2.1.1 树脂的选择和氨基酸的固定 固相合成法与液相合成法分开来的最主要的特征是固相载体，多肽合成的固相载体须满足如下要求：必须包含反应位点（或反应基团），以使肽链偶联在这些位点上，也要便于多肽与载体的分离；合成过程中的物理和化学条件稳定，不能出现太多的副反应；载体须在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；载体必须能有允许提供足够的生长点，以使每单位体积的载体给出有效产量的多肽，而且须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。常用于固相法合成多肽的载体主要有三种：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺和聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂需要先导入反应基团才能偶联上（第一个）氨基酸。根据其所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。叔丁氧羰基（Boc）合成法通常选择氯甲基树脂，如Merrifield树脂；Fmoc合成法通常选择羧基树脂，如Wang树脂。 氨基酸的固定主要是同保护氨基酸的羧基与树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，它们形成共价键的方式各有不同：氯甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐、钠盐、钾盐或铯盐，在一定的温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如N，N-二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO）中反应；羧基树脂，则通常加入适当的缩合剂如二环己基碳二亚胺（DCC）或羧基二咪唑，使树脂与被保护氨基酸形成酯键来完成氨基酸的固定；氨基树脂或酰肼型树脂，是加入缩合剂如DCC后，使树脂与保护氨基酸之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。2.1.2 氨基、羧基、侧链的保护和去除 为了保证氨基酸顺序的多肽成功合成，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基、羧基和氨基酸侧链上的活性基团进行保护，反应完成后再将保护基团除去。同液相合成一样，固相合成中多采用不易发生消旋的烷氧羰基类型作为氨基的保护基。最早是用苄氧羰基，但缺点是需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧羰基保护，用TFA（三氟乙酸）去除保护基团，但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。1978年，Chang Meienlofer和Atherton等人发展了Carpino报道的Fmoc（9-芴甲氧羰基）作为氨基保护基，由于Fmoc基对酸很稳定，用哌啶-二氯甲烷或哌啶-DMF便可脱去，近年来，Fmoc合成法得到了非常广泛的应用。 羧基通常用形成酯基的方法进行保护。其中甲酯和乙酯是合成中保护羧基的常用方法，去保护时可通过皂化除去或转变为肼以便用于片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去。而合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽时，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团保护起来。保护基的选择原则是既要保证侧链基团不参与形成酰胺键的反应，又要保证在肽合成过程中不受破坏，同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。所以如半胱氨酸的S-用三苯甲基保护，用酸或银盐、汞盐除去；组氨酸的咪唑环用2, 2, 2-三氟-1-苄氧羰基和2, 2, 2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保护，可通过催化氢化或三氟乙酸脱去；精氨酸用金刚烷氧羰基保护，用三氟乙酸脱去。 2.1.3 缩合反应与裂解 固相中的偶联反应原理与液相中的基本相同，将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，而需要将羧基活化，从而使羧基碳原子亲电性增强，使另一个氨基酸的氨基的亲核进攻更加容易而发生偶联反应，形成肽键。Boc法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，Fmoc法则直接用TFA，但有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等其它脱保护方法也被采用。2.2 实验试剂与仪器 9-芴甲氧羰基（Fmoc）氨基酸为Chemassist公司产品；Rink Resin 树脂在天津南开和成公司购买；还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCL）、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯（HCTU）、二巯基乙烷、苯甲硫醚、三氟乙酸（TFA）、-氰基-4-羟基-肉桂酸（CCA）等为Sigma公司产品；二甲基甲酰氨（DMF）购自美国Tedia公司；乙腈（色谱纯）购自湖南化工研究院精细化工研究所；N-甲基吗啡啉（NMM）、哌啶（piperidine）均为国产重蒸试剂。分析型高效液相色谱：Waters 2690 Alliance System、996 PDA检测器；半制备型高效液相色谱Waters 515 pumo & Empower System、2487检测器；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Ultraflex TOF/TOF，Bruker公司）；PS3 固相多肽合成仪。2.3 实验方法2.3.1 多肽的仪器合成与裂解采用Fmoc-氨基酸和HCTU偶联的固相多肽化学合成方法，在PS3固相多肽合成仪上按0.1 mmoL规模合成JZTX-XI、JZTX-XI突变体R3A-JZTX-XI。Rink Resin 树脂偶联替代值为0.35 mmoL/g放入带筛板的PS3固相多肽合成仪中，合成过程中Fmoc-氨基酸的用量为5倍过量（0.5 mmoL），每个合成残基的偶联时间为40 min，用20%的哌啶/DMF（体积比）去除末端Fmoc-基团。全部氨基酸偶联完成并去除最后一个氨基酸残基的Fmoc基团后，分别用DMF、甲醇和二氯甲烷充分洗涤树脂。将树脂冷冻干燥后，然后将树脂放入带筛板的BIO-RAD反应柱中，使用裂解试剂K（TFA 6.3 mL、苯甲硫醚 0.35 mL、二巯基乙烷 0.21 mL和苯硫醚 0.14 mL（体积比）将合成多肽从树脂上裂解下来，在摇荡机中摇晃避光反应3小时，完成侧链保护基团的去保护和从树脂上将多肽切下。将裂解液转移到50 mL离心管中。再用少量TFA清洗肽树脂及合成柱内壁，一般清洗三次共用TFA约6 mL，滤液同样一起转入50 mL离心管中。小心用氮气吹去离心管中的TFA，使其挥发直至浓缩到1 mL左右，加2-3 mL冷乙醚，静置30 min，在10000 rpm转速下离心10 min，倒掉上清。封膜，刺孔，冷冻冻干，得到合成的多肽粗品。2.3.2 多肽的分离纯化与质谱鉴定多肽粗品利用半制备型的反相HPLC进行分离纯化（反相柱：10 250 mm Phenomenex C18 column），洗脱梯度见表 2-1。（洗脱液A：0.1% TFA 的水溶液；洗脱液B：0.1% TFA in ACN，洗脱为：B液25%-35% 20 min；流速 3.0 mL/min），利用MALDI-TOF- TOF质谱分析各峰的分子量，以确定目的峰所在的位置，然后收集目的峰真空冷冻干燥。再选取目的峰用分析型的反相HPLC在Waters Alliance上分离纯化（反相柱：Waters 4.6 250 mm Bridge shield RP C18 column）；洗脱梯度同上，流速为1.0 mL/min，通过上述两次分离纯化确保合成产品纯度达到95%以上，然后冻干备用。利用MALDI-TOF- TOF质谱测定分子量。线性阳离子模式；氮气光源337 nm；离子加速电压设置为20000伏。基质为-氰基-4-羟基肉桂酸（CCA）。质谱样品准备：取1 L（约0.5微克）样品液体加入到1 L CCA (0.1% TFA