染色体分析相关的实验.doc

莁袅袁肈蒄蚈袇肈蚆羃膆肇莆螆肁肆蒈羁羇肅薀螄袃肄蚃薇膂膃莂螃肈膂蒄薅羄膂蚇螁羀膁莆蚄袆膀葿衿膅腿薁蚂肁膈蚃袇羇膇莃蚀袃芆蒅袆蝿芆薈虿肇芅芇袄肃芄蒀螇罿芃薂羂袅节蚄螅膄芁莄薈肀芀蒆螃羆莀薈薆袂荿芈螂螈莈莀薅膆莇薃袀肂莆蚅蚃羈莅莅袈袄莄蒇蚁膃莄蕿袇聿蒃蚂虿羅蒂莁袅袁肈蒄蚈袇肈蚆羃膆肇莆螆肁肆蒈羁羇肅薀螄袃肄蚃薇膂膃莂螃肈膂蒄薅羄膂蚇螁羀膁莆蚄袆膀葿衿膅腿薁蚂肁膈蚃袇羇膇莃蚀袃芆蒅袆蝿芆薈虿肇芅芇袄肃芄蒀螇罿芃薂羂袅节蚄螅膄芁莄薈肀芀蒆螃羆莀薈薆袂荿芈螂螈莈莀薅膆莇薃袀肂莆蚅蚃羈莅莅袈袄莄蒇蚁膃莄蕿袇聿蒃蚂虿羅蒂莁袅袁肈蒄蚈袇肈蚆羃膆肇莆螆肁肆蒈羁羇肅薀螄袃肄蚃薇膂膃莂螃肈膂蒄薅羄膂蚇螁羀膁莆蚄袆膀葿衿膅腿薁蚂肁膈蚃袇羇膇莃蚀袃芆蒅袆蝿芆薈虿肇芅芇袄肃芄蒀螇罿芃薂羂袅节蚄螅膄芁莄薈肀芀蒆螃羆莀薈薆袂荿芈螂螈莈莀薅膆莇薃袀肂莆蚅蚃羈莅莅袈袄莄蒇蚁膃莄蕿袇聿蒃蚂虿羅蒂莁袅袁肈蒄蚈袇肈蚆羃膆肇莆螆肁肆蒈羁羇肅薀螄袃肄蚃薇膂膃莂螃肈膂蒄薅羄 第三章 染色体分析相关的实验目前染色体的研究几乎深入到每个学科的每一个领域，因为染色体是把细胞与分子联系起来的重要桥梁，故在遗传学研究中或者在医学研究中被广泛重视及应用。近几年相继出现了脆性位点、热点、重排与癌基因激活及抑癌基因丢失，癌基因定位、抑癌基因定位及杂合位点缺失等与染色体相关的理论；另一方面与染色体畸变有关的各类遗传病的研究也使临床上染色体的分析上了一个新的台阶。染色体分析相对较简单，细胞通常采用循环血中的淋巴细胞，胎儿采用羊膜液中的羊膜细胞或胎盘绒毛膜细胞。细胞经过培养，再用植物凝集素（PHA）刺激细胞分化。当每个染色体都复制成两个染色体单体时，随后加入秋水仙素，在分裂中期阻止细胞有丝分裂。位于载玻片上的细胞随后被染色，在显微镜下拍照或用计算机进行图像分析。根据染色体形态大小,剪下照片上的染色体，按序分类排贴在纸上,进行核型分析。染色体显带通常通过G显带或Q（荧光）显带染色技术进行，增加其他染色方法可提高细胞遗传学诊断的准确性。新的分子生物学技术使用DNA探针(含有荧光标记)来定位染色体上特定基因和DNA序列，荧光素标记的原位杂交技术可用于鉴别基因结构和寻找染色体缺失，重排及复制。实验3-1 人类染色体标本的制备一、实验目的掌握人类外周血细胞培养方法及染色体标本的制备方法。观察人类染色体的形态和数目。二、实验原理血液中的T淋巴细胞在体外培养中经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，可以返幼进行细胞分裂，用秋水仙素积累分裂相，用0.075 mol/L-1KCI进行低渗后，经固定、染色，可见到分散的染色体。三、实验准备 超净工作台、酒精灯、无菌注射器（1ml、2ml、5m1）、针头、培养瓶、橡皮塞、75酒精棉球、离心机、定时钟、试管架、量筒、刻度离心管、冰凉玻片，毛细滴管、恒温水浴锅、RPMI1640、小牛血清、肝素、秋水仙素、植物血凝素（PHA）、固定液（甲醇：冰乙酸为31，现用现配）、0.075mol。L-1KCI低渗液、Giemsa染液、pH6.8磷酸缓冲液、恒温培养箱、吹风机、粗天平、5NaHCO3、显微镜。四、实验方法与步骤（一）接种取500单位/lml的肝素0。2ml湿润针筒后，取静脉血12ml，转动针筒以混匀肝素；随后立即插入灭菌小瓶内，送入超净工作台（消毒、灭菌等略），在火焰旁将血液滴入23个盛有5ml培养液（4ml RPMIl640、lml小牛血清，5mg PHA，用5的NaHCO3调pH至7.07.4）的培养瓶内，每瓶0.20.3ml（7号针头13滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。（二）培养1将培养瓶放在37恒温箱内培养72h。2在终止培养前24h，将0.01的秋水仙素12滴（7号针头）加入培养瓶内，轻轻摇匀放回温箱内，继续培养24h。（三）收获1用吸管充分吹打瓶壁，吸取培养物移入刻度离心管内，相对离心管平衡后放入离心机，离心8min（1000转/分），吸去上清液，留下沉淀物。2低渗处理：加8ml预温（370C）的0.075mol。L-1KCI低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，放回37恒温水浴锅中，静置1520min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。3预固定：加入固定液12ml打匀。4再离心：1000转/分离心8min，吸去上清液，留下沉淀物。5固定：沿离心管壁加入新配固定液8ml打匀，固定30min。6再离心：1000转/分离心8min，弃去上清液，留下沉淀物。7再固定：再加入新配固定液8ml，打匀，静置30min。8再离心：1000转/分离心8min，弃去上清液。9第四次固定：加入新配固定液0.5lml打匀成细胞悬液。10制片：用滴管吸细胞悬液23滴，滴在冰水预浸泡的洁净载玻片上，立即用口吹散，在酒精灯上过几次，吹风机吹干或气干。11染色：Giemsa染液（原液pH6.8磷酸缓冲液为19）染色10 min20min、自来水冲洗、晾干。（四）镜检低倍镜下找到分散良好的分裂相后，换高倍镜、油镜、认真观察。（五）注意事项1PHA是体外淋巴细胞培养成败的关键问题，因此，要考虑它的质量和浓度。盐水提取物一般冰冻保存的时间不宜过长，时间长了效价减低。2浓度一般用12，每毫升培养液加0.20.4ml；浓度过高可能会导致红细胞凝集。 3秋水仙素溶液浓度和处理时间。一般最终浓度每毫升培养液0.10.2g为宜，作用时间为35h，一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系。如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊。 4培养温度应严格控制在37+0.5。5双蒸水必须用玻璃蒸馏器制备，pH应在67之间。6低渗步骤极为重要，关系到染色体分散的好坏，因此，低渗液浓度与低渗的时间应掌握适当。7离心机最好用水平式的，速度不宜过快。速度太快细胞团不易打散，反之分裂相易丢失；固定液应在临用时新鲜配制，固定一定要彻底、均匀。若打散不够，则细胞在玻片上易集结。8若吹打时用力过猛，细胞易破碎，以致染色体数目不完整；培养液的pH值应掌握在7.4土0.1左右，pH值偏酸发育不良，偏碱时细胞出现轻度固缩。 9玻璃器皿都要十分干净、无酸，所用试剂以分析纯为好。10操作过程应保持高度无菌概念，严防细菌和病毒污染；在外周血培养中，PHA对淋巴细胞的作用，个体差异较大。同样方法和条件，分裂相多少及分散情况不一样。因此，若首次失败，应充分考虑到这些因素。（五）预期实验结果及分析将制作好的片子在油镜下仔细观察，选择较好的分裂相进行照相、剪贴、分组，将照片上的核型进行剪贴，写出实验报告与实验结果。染色体数目为46XX，（XY）为人类正常核型。若某对染色体少了一条（2n-1），细胞染色体数目为45；或某一对染色体多了一条（2n+1），细胞染色体数目为47；若为两种核型，46，XX/46，XXY称为嵌合体。以上三种为异常核型。 （吴白燕）实验3-2、染色体显带技术一、实验目的了解G显带标本的制作过程；并通过G显带核型分析，初步掌握各号染色体G带的带型特征。二、实验原理染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本身更细微的结构，有助于准确的识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。显带染色体是染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹，称为染色体带，这种染色体显带的技术，称为显带技术。通过显带技术，使各号染色体都显现出独特的带纹，这就构成了染色体的带型。每对同源染色体的带型基本相同而且稳定，不同对染色体的带型不同。在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。一套单倍体染色体带纹数仅有320条带。70年代后期，由于技术的改进，可以从早中期、前中期、晚前期细胞得到更长、带纹更丰富的染色体。一套单倍体染色体即可显示550850条或更多的带纹。即在原有的带纹上分出更多的带，这种染色体称为高分辨显带染色体（high resolution banding chromosome，HRBC）。三、实验准备（材料、试剂、仪器）染色体显带技术的实验准备除必要的器材（普通光学显微镜、37水浴箱、普通冰箱、立式染缸、直头小吸管、橡皮吸头、pH试纸、吸水纸、扣染玻璃板、擦镜纸、镊子）和试剂（0.9%生理盐水、0.025%胰蛋白酶溶液、Giemsa染液、3.8%NaHCO）外，应选择已制片的染色体标本背景干净、分裂相较多、染色体分散良好的玻片。片龄25天最宜，此制片需经80烘烤四、实验方法与步骤 （一）实验步骤1首先将配制好的0.025%胰酶溶液装入立式染色缸中并调pH值77.2，并将其放入37恒温水浴箱中预温。2取染色体制片一张置胰酶缸中处理15sec左右，迅速投入0.9%生理盐水缸中漂洗数sec（可准备两缸盐水，做两次漂洗）。3用自来水稀释后的Giemsa染液（自来水吉姆萨原液=81）扣染15min20min。4将标本用自来水冲洗、晾干，必要时可封片、镜检。镜检时，先在低倍镜下选择分散好、长度适中的分裂相，然后转换油镜观察其显带的情况，选择显带好的标本进行G显带核型分析。5挑选出分裂相数目完全且带纹清晰的分裂相，进行显微照相、冲洗、放大，制成人外周血淋巴细胞G显带中期分裂相照片。（二）G显带核型分析 准备G显带中期分裂相照片一张，将各条染色体逐一剪下，根据其大小、带型特点和着丝粒位置，依次分组、配对和排列组合，待检查无误后，贴在报告纸上。写出核型的简式（繁式）。（三）注意事项1如在滴片后第二天进行G显带，可在胰酶处理前，将染色体制片置80烤箱烤片两h。2胰酶预温时要注意预温温度，温度过高，胰酶变性失效。3胰酶溶液需在使用前新配制。染色体在胰酶中的处理时间可因制片质量、片龄不同而不同。在不同个体的染色体制片中也可有差异，此外，不同厂家生产的胰酶或不同批号的胰酶，在处理时间上都可有差别，故每次进行染色体G显带时，最好先试做一张制片，摸索胰酶处理时间，以保证获得最好的染色体G显带标本。（四）预期实验结果及分析1获得带纹清晰的G显带染色体标本。2在显微镜下观察染色体G显带核型，分析染色体的数目和结构3结合实验体会，写出实验报告交老师。 （吴白燕）实验3-3 姐妹染色单体技术姐妹染色单体交换（sister chromatid exchange，SCE）技术，是20世纪70年代继染色体显带技术之后，细胞遗传学研究中展现的的又一新技术。SCE交换技术是指能够显示姐妹染色单体在相同位置上同源对称片断的交换。由于SCE比染色体畸变敏感，一时间成为评价染色体损伤修复的一项遗传学指标，广泛的应用于研究DNA修复不完全综合症，细胞周期动力学分析及检测致突变物质和致癌物质等领域。SCE技术方法中所选择的材料根据研究目的不同而有差异，在毒理实验中体外实验多采用可贴壁生长的细胞，如CHO、V79和CHL细胞，也可以用悬浮生长的细胞，如人外周血淋巴细胞、骨髓液等；在体内动物实验中，一般要设计三个剂量组及阴、阳性对照组，选择的动物常用35月龄的小鼠，可选择骨髓细胞，睾丸生殖细胞，再生肝细胞，肺巨噬细胞等进行SCE试验。大量研究证明，哺乳动物的各种细胞的SCE数，在一定实验条件下几乎是恒定的，称为自发的SCE，通常以每个M2中期有丝分裂细胞中所见的SCE数表示（简写为SCE/C）。自发SCE的意义及产生机制尚不清楚。文献报道，小鼠尾静脉灌注Brdu 2.2g13.5g/g/h，骨髓细胞为1.64，脾细胞为1.99，精原细胞为1.82，小肠细胞为2.89。当Brdu终未浓度为3g/ml培养液，人淋巴细胞的SCE正常值为8.623.12。但也发现，人周围血淋巴细胞中的SCE频率变异很大，变异的范围为245/细胞。对非接触个体的这种变异受到很多因素的影响，例如培养中的诸多因素和生物学的许多因素（年龄、性别、膳食、基因型、医药和吸烟等）。因此，对SCE频率在其基线以上边缘性增加的解释要特别慎重。SCE频率水平明显增加可表示人群曾接触了遗传毒物，但若未观察到其频率水平增长，也不一定就表明没有接触。 由于使SCE显示阳性的化学物常为致癌原或诱变剂，利用它们之间的平行关系，SCE技术提供了一种快速、简便的技术检测突变致畸和致癌物。利用SCE方法作体内和体外的动物实验，对毒进行检测，也可对接触毒物的工人抽血作淋巴细胞培养，观察生产环境有害因素及环境因素对人体的影响，也可以用于研究细胞生长动力学。一、实验目的掌握人外周血淋巴细胞染色体SCE标本的制备技术；熟悉SCE标本的观察及分析方法。二、实验原理5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）是脱氧胸腺嘧啶核苷（deoxythymidine，TdR）的类似物。当人体外周血淋巴细胞在含有BrdU的培养液中增殖时，BrdU可取代TdR而掺入到新复制成的DNA子链中，由于DNA的复制是以半保留的方式进行的，故当细胞经历了两个增殖周期后，其中染色体的二个单体的DNA双链在化学组成上便出现了差别，即一个染色体中的DNA的双股单链都掺入了BrdU，另一股则不含BrdU。由于双股都含BrdU的DNA分子具有螺旋化程度较低的特性，从而降低了与某些染色剂的亲和力，故当用Giemsa染料染色时，双股都掺入有BrdU的DNA分子所形成的染色单体着色较浅。而另一条染色单体由于所含的DNA分子仅有一股单链掺入了BrdU，可被Giemsa深染。 在染色体的复制过程中同一条染色体上的两条染色单体所发生的遗传物质的等位点交换，称为姐妹染色单体互换（sister chromatid exchange，SCE）由于经过BrdU处理的细胞中染色体的两条姐妹染色单体的着色程度明显不同，所以如果姐妹染色单体出现了片段的交换就很容易被观察到。在互换处可见一界限明显、颜色深浅对称的互换片段。 现已证明，许多诱发剂和致癌剂都可诱发SCE，使细胞的SCE频率升高，故SCE频率是DNA损伤的灵敏指标，由于SCE分析比染色体畸变分析更灵敏、简单，所以该技术已成为检测致突变物和致癌物的一种手段。三、实验准备（一）材料人外周血（二）器材光学显微镜、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、20w紫外线灯、培养瓶、10ml刻度离心管、吸管、试管架、注射器（1ml、2ml）、酒精灯、载玻片、天平、小烧杯、染色缸、黑纸、擦镜纸。（三）试剂RPMI1640培养液、PHA、肝素、2SSC、500mg/ml的BrdU、pH6.8磷酸缓冲液、Giemsa染液。（四）试剂的配制1500mg/ml BrdU 在分析天平上用无菌小瓶称取Brdu粉4.2mg，加入8.4 ml无菌生理盐水，摇匀后即成500mg/ml的BrdU溶液，黑纸包好置4冰箱保存。22SSC溶液 先配制A液（0.30mol/L 氯化钠 ：将17.54克氯化钠溶解在蒸馏水中，最终使液体为1000ml）和B液（0.030mol/L柠檬酸钠：将8.82克柠檬酸钠溶解在蒸馏水中，最终使液体为1000ml）；使用时将A和B两溶液等容量混合即成2SSC溶液3常规配制RPMI1640培养液、Giemsa染液、肝素液。四、实验方法与步骤（一）细胞培养（人外周血淋巴细胞培养）1接种 无菌抽取外周全血0.20.3ml（肝素抗凝），接种在5ml含有PHA的RPMI1640培养液中，37培养箱培养。2加Brdu 在培养24h加500g/ ml，Brdu液0.1 ml，使培养液中BrdU终浓度为10g/ ml，昆均后，培养瓶有黑纸包瓶遮光，继续培养48h。3加秋水仙素：在收获细胞前23h（即培养到69h70h）加秋水仙素（终浓度为0.2g/ml培养液）（二）收获细胞和制备染色体玻片收获细胞及染色体标本制片均与实验三相同。（三）标本老化将制好的染色体玻片置37培养箱2天或在60干烤箱烤片2h。（四）差别染色紫外线照射法1将老化好的染色体玻片标本放入一平皿中（最好用牙签放在玻片下面），在玻片上盖一张稍大些的玻片擦镜纸，使纸的四边垂于平皿中，滴加2SSC液到纸上，使擦镜纸全部温润，使平皿中放入的2SSC溶液与玻片水平，保证有充足的2SSC液渗至标本上保持标本温润。2将平皿置于56的水浴箱中，使平皿底部接触水面。3在水浴箱上架一支20W的紫外线灯，使灯管与标本的距离6左右，开灯照射30min。4照射完毕，用镊子轻轻揭去擦镜纸，用自来水轻轻冲洗玻片。51：10Giemsa染料染色5min10min（不要着色过深）6自来水冲洗晾干后即成SCE标本（五）注意事项1BrdU溶液最好现用现配，一次用不完，必须用黑纸（布）包裹避光，4冰箱保存。2BrdU是强的致突变剂，使用浓度不易太高，在每毫升含25mg左右的剂量下不影响细胞增殖。在培养24h后加入均可。3用紫外线照射诱发姐妹染色单体分化时，如紫外灯功率大，照射时间应相应减少。一般在20w的紫外灯距标本距离应在6cm左右；如果在15w紫外线灯照射时距离标本应在4左右。温度要控制在5060（冬天最好是5560），但不应超过60。如果时间过长或温度过高都造成染色体肿胀。六、预期实验结果及分析（一）预期实验结果在某些进入第二次复制中期的分裂相中，清晰可见姐妹染色单体分染为一深一浅图像，可观察到姐妹染色单体同源片段等位交换相。（二）实验结果观察分析1选择在加入Brdu之后经过两个复制周期，姐妹染色单体分化着色清晰，染色体分散良好，长短合适和染色数目完整的中期分裂，进行观察分析。2SCE交换次数判定：染色体某臂端部交换算1次交换，臂间交换算2次；着丝粒处发生交换（需排除染色体在此发生扭曲）计一次。3每个标本分析3050个中期分裂相。4SCE率计算SCE率=累计互换数/观察细胞数=SCE/细胞（三）细胞周期动力学（cell cycie Kime Tiex，cck）计数1每个样品分析中期细胞100个；2计算M1M5 细胞百分比；3根据姐妹染色单体形态分染程度，分类形态规定：第一周期细胞（M1）为条同源染色单体均匀深染；第二周期细胞（M2）为两条姐妹染色单体分染为一深一浅；第三周期细胞（M3）为一个细胞中两条染色单体均为浅染与两条染色单体中一深一浅各占1/2；第四周期细胞（M4）为一个细胞中1/4分染为一深一浅，3/4均为浅染；第五周期细胞（M5）为一个细胞中几乎所有染色体为浅染。七、实验结论计算样品的SCE率，分析该个体的染色体稳定程度；同时分析细胞周期动力学，计算各细胞周期（M1 M5）比例，了解细胞生活能力和代谢活性，在理论分析后形成实验报告交老师。（杨康鹃 金雄吉）实验3-4 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核检测细胞在受到射线、化学物质等有害因素作用后，可产生除细胞核以外的次级核，研究证明，微核的化学成分与细胞主核相同，因其体积很小，故称微核。多数学者认为细胞通过两种机制产生微核：染色体断裂剂导致染色体断裂，产生的无着丝粒断片或环不能进入子细胞核，被包含在子细胞的胞质内，单独形成一个或几个规则的微核。纺锤丝毒性药物（如秋水仙碱等）能抑制纺锤丝的形成，破坏染色体和纺锤体的连接，阻止细胞分裂中期纺锤丝将染色体拉至细胞的两端，染色单体行动滞后，不能进入子细胞的主核，而形成了一组微核，体积往往略大于一般典型的微核。由于微核的产生与染色体和DNA损伤有较大关系，故常将微核的检出率作为DNA损伤的一种指标。微核试验（Micronucleus test，MNT）方法可分成两大类，一类是从外周血中分离淋巴细胞，常规涂片即可，称直接法。该法制作简便、快速，适用于大面积的人群普查，但理论上未经分裂的细胞不能形成微核，而连续分裂的细胞中染色体的无着丝粒断片会逐渐丢失，因此，直接法的微核检出率低，敏感性较差，在准确反映染色体损伤方面一直有质疑。另一类是培养法，即将细胞经体外培养后再制片，因微核在细胞周期各个阶段均可形成，故该法微核检出率高，敏感性较直接法强，而且制备的标本胞浆完整、染色清晰。1985年，Fenech等人用细胞松弛素B（Cyt-B）阻断胞质的分裂，使分裂一次的细胞具有双核的特征，观察试验结果时，只计数双核细胞的微核，提高了微核测试的敏感性，此法称胞质分裂阻滞微核法（cytokincsis-block micronucleus method）。 微核技术与其他技术结合，实验方法日趋完善，试验选材范围越来越广。1991年，Kamigichi用人精子二细胞胚微核技术研究射线体外照射健康人精子后的遗传效应，1994年，Graws用流式细胞仪测定微核，使检测与数据分析均自动化，而且可同时检测微核的DNA含量，提供微核形成的信息，适用于任何化合物致突变性的评价。可用于微核试验的生物材料种类繁多，如小鼠、大鼠、中国仓鼠、猕猴、豚鼠等，各种实验动物中，小鼠价格便宜，骨髓中干扰因素少，是微核试验的常用动物。一、实验目的 熟悉微核实验的基本原理和意义。二、实验原理多种环境化学物质可导致细胞中染色体或纺锤体的损伤，产生的染色单体或染色体无着丝粒断片在细胞分裂末期滞留在子细胞胞质中，形成微核。环磷酰胺因具有显著的诱变作用，而常被用作骨髓微核试验的阳性对照物。本实验用环磷酰胺作诱导剂，促使细胞中染色体断裂，产生微核。除此之外，射线、顺铂等也常用作阳性对照物或诱导剂。骨髓嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte，PCE）中主核已排出，微核经Giemsa染色后色泽鲜红，胞质内含有核糖体，被染成淡灰蓝色，微核与胞质形成鲜明的对比，易于鉴别；而成熟红细胞中的核糖体已溶解，被染成淡桔红色，与PCE区别明显。三、实验准备（一）材料23月龄、体重18g22g的健康小鼠。（二）试剂 1小牛血清：滤菌后放入56恒温水浴保温1h进行灭活，4储存。亦可用大、小鼠血清代替。2Giemsa原液：称取Giemsa染料3.8g，加入375ml甲醇（分析纯）研磨，待完全溶解后，加甘油125ml，37恒温箱保温48h，振摇数次，过滤，两周后可使用。3磷酸盐缓冲液（pH6.8）： KH2PO4 4.50g、Na2HPO412H22O 11.81g、蒸馏水至1000ml4甲醇5环磷酰胺（三）器材 1ml注射器、解剖器械、低速离心机、5ml离心管、毛细吸管、载玻片、染色缸、显微镜、计数器。四、实验方法与步骤 （一）实验步骤1染毒 小鼠腹腔注射环磷酰胺40mg/kg体重。2取材 以颈椎脱臼法处死小鼠，取两腿股骨，剔净肌肉，擦去附着在上面的血污，剪取两端股骨头，暴露骨髓腔，用注射器吸取1ml灭活小牛血清，将针头插入骨髓腔上段冲洗，用试管接收冲洗液，即成骨髓细胞悬液。3离心 1000r/min离心5min，弃大部分上清液，留少许液体，用毛细吸管将细胞团块轻轻吹打均匀。4涂片 混匀后的液体滴1滴于载玻片上，血常规涂片法涂片，自然干燥。5固定 玻片标本置于甲醇溶液中固定5min10min，晾干。6染色 Giemsa原液用磷酸缓冲液按110的比例稀释，染色10min。自来水轻轻冲去多余染液，晾干，镜检。7观察 先在低倍镜下选择细胞分散均匀、形态完整、染色良好的区域，再转到油镜下，观察嗜多染红细胞的微核。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，偶尔呈肾形、马蹄形或环形，嗜色性与主核一致，直径通常为红细胞的1/201/5。每张玻片标本计数100200个嗜多染红细胞，按“”计算微核的出现率，微核计数以“细胞”为单位，即1个细胞中出现2个或2个以上微核时，只按“1”计算。（二）注意事项1小鼠股骨较短、细，剪股骨头时，应尽量保持股骨中段的完整。2染液浓度、p、染色时间等多种因素可影响染色效果，例如微核可被染成鲜红色、蓝紫色或紫红色，甚至同一张标本上也会出现染色深浅不一致的现象，因此，计数前时必须仔细观察PCE和成熟红细胞的差别，正确辨认。3室温较低时，可适当延长染色时间。4正确掌握微核的形态特征，避免假阳性。PCE中的RNA颗粒、含酸性多糖的颗粒以及一些附着的染料颗粒等经Giemsa染色后与微核颜色一致，易与微核混淆，应注意辨别。在实际应用中，如有必要，可采用其他方法重复试验，以排除假阳性。5制片后，以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。五、预期实验结果及分析（一）实验结果为阳性给药组与对照组微核率有明显的剂量反应关系并有显著性差异（P0.01）时，可认为是阳性试验结果。说明该化学物质能引起染色体断裂，是一种DNA断裂剂，但要排除假阳性。若统计学上有显著性差别，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验，结果能重复者可确定为阳性。（二）实验结果为阴性实验结果为阴性时，下结论要十分慎重。出现阴性结果的主要原因有以下几点：1被筛选的化学物质不引起微核率增高；2制片时间不当：有些断裂剂能延迟红细胞的分裂和成熟，使出现微核的高峰时间推迟，因此，应根据根据细胞周期和不同物质的作用特点，定取材时间。可先做预试，一般为30h。 3剂量过高或过低：各种化学物质的理化性质、体内代谢途径不同，应根据实验需要，根据药物的特点选择给药途径。例如，骨髓实验需短时间内达到有效浓度，应选用腹腔注射或口服用药。六、实验结论 每位学生观察并计数50100个嗜多染红细胞中的微核细胞，以小组为单位，统计数据，得出微核细胞的千分率，并将结果写成实验报告交老师。（李晓雯）实验3-5 荧光原位杂交原位杂交（In Situ ybridization，ISH）是一种在维持组织、细胞或染色体固有形态结构的基础上对其内部核苷酸序列进行特异检测及定位的分子生物学手段，已成为分子遗传学与细胞遗传学之间的桥梁，并由此诞生了分子细胞遗传学。ISH的原理是将特殊标记或修饰的核苷酸探针与已固定的组织、细胞或染色体中的DNA或RNA杂交，并通过分析探针在被检对象中的显示状况，以完成目的核酸序列检测或定位。早期的ISH技术是以放射性同位素标记探针和放射自显影技术为基本手段。由于放射性同位素标记法具有一定的危险性以及操作烦琐，而逐渐被荧光法、酶沉淀法或发色团检测等方法所取代。1981年，Roumam应用荧光素标记的cDNA作原位杂交，首次建立了荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术。同年，Langer等用生物素标记核苷酸制备探针，其后成功地在组织切片上检测到病毒DNA。FISH是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法。由于其操作安全简便、观察分析容易、立体分辨率高和信号明亮清晰，而成为目前最常用的ISH手段之一，并通过改进形成一系列技术。FISH技术的优点在于：探针稳定、操作安全、快速、特异性高；多色Fish可以在同一核中显示不同的颜色，从而同时检测两种或多种序列。目前已可用5种荧光素显示23种颜色来代表23对染色体，从而使核型分析直观简单；Fish也可用于间期细胞核内DNA的三维结构的显示;反向染色体涂染可以准确、客观地辨别新生染色体的来源；微矩阵（microarray）技术和组织矩阵（tissue array）技术使得一次性检测几百个基因或几百个组织成为可能；加速了对检测的速度。已逐渐用于细胞遗传学、产前诊断、核组成、基因定位、基因扩增和缺失的检测及肿瘤生物学等领域。一、FISH基本知识（一）FISH常见类型1原位杂交显带技术在人类短重复序列中存在AluDNA重复家族，其片段约为300bp长，在基因组中重复约9000000次。Nelson等建立了Alu-PCR法，以Alu序列作为引物扩增Alu间的DNA。由于Alu序列在基因组中分布不均，只有在致密区可以扩增出产物。以产物制备探针，通过杂交可以在染色体上形成类似R带的荧光带型。以不同的荧光物质标记目的探针与Alu-PCR探针，将可在染色体上同时显示杂交信号和染色体带型，这种荧光原位杂交技术称为原位杂交显带技术（in situ hybridization banding，ISHB）。2染色体原位抑制杂交 在染色体文库探针、cosmid和YAC探针中，常存在Alu-Kpnl等重复序列家族探针，它们将干扰探针识别靶顺序的特异性。Lichter和Pinkel等各自应用经过超声破碎制备而成的500bp左右的人类总DNA（THDNA）片段，以一定比例与探针混合、变性。变性后，在37C孵育而完成THDNA与探针中重复序列之间的退火，此后再与染色体杂交，实现与靶序列之间的特异结合，这种技术称为染色体原位抑制杂交（chromosome in situ suppression，CISS）。3多色荧光原位杂交FISH一个最大的特点是可利用不同颜色的荧光素标记不同的探针，同时对一张制片进行杂交，从而对不同的靶同时进行定位和分析，并能对不同探针在染色体上的位置进行排序，形成多色FISH（mFISH）。（1）组合标记FISH（combinatorial FISH）利用几种不同颜色的半抗原或荧光素同时标记一个探针，组合标记原则上可标记的探针数为2-1（为半抗原或荧光素的个数）；比例标记FISH（ratio labelling FISH）应用不同比例的各种荧光素标记每个探针，并进行组合标记FISH，可以完成定量分析；多色染色体涂色（multicolor chromosome painting）是利用组合标记FISH或比例标记FISH对染色体、染色体臂或染色体带特异性涂色探针进行标记而进行的mFISH。（2）比较基因组原位杂交（comparative genomic hybridization, CGH）是一种改进的FISH，其原理是对待检测的DNA（如肿瘤细胞DNA）和相应的正常细胞DNA进行不同颜色的标记（如肿瘤细胞DNA标记为红色，正常细胞DNA标记为绿色），同时对正常细胞的中期染色体进行杂交，然后根据两种探针荧光信号的强度差异判断待测与对照基因组DNA序列的拷贝数之比，找出待测基因组中的DNA扩增和缺失等变异，并描绘出相应的CGH核型图。4DNA纤维FISH（DNA fiber FISH）是一种应用各种不同的方法将细胞中的DNA在载玻片上制备出DNA纤维，用不同颜色荧光物质的探针与之杂交，并在荧光显微镜下观察结果以及进行分析。与其他FISH相比，纤维FISH主要有如下优点：高分辨率和定量分析，可以分辨率可达1500kb；模板要求不高，各种方式制备的线性DNA分子均可使用；DNA需要量较少；灵敏度高，可达200bp。但也存在一些固有的缺点：DNA纤维的随机断裂可能导致同一探针的信号长度不一致；DNA纤维伸展的程度不一，导致不同荧光相互干扰，影响定量分析；从纤维FISH的结果不能判断探针究竟具体位于哪条染色体上；以同源的串联重复DNA序列为探针，杂交后在纤维上散在分布的重复序列会产生杂交的信号不连续等。DNA纤维FISH在遗传学上具有广泛的应用，其不仅应用于精确作图和辅助基因克隆，而且也可定量分析不同克隆之间的排列顺序及重叠程度；定量检测染色体重排和缺失等异常；分析靶序列的拷贝数；决定基因之间的物理距离及其53定向；测量DNA座位的长度等。（二）FISH的一般程序1样本制备用于FISH的样本可以来自于常规的血涂片、常规方法制备染色体玻片以及石蜡或冰冻切片等。为降低本底，杂交前可用RNA酶和蛋白酶消化处理标本,然后再将玻片在70%甲酰胺中热处理一定时间，使DNA变性，然后于冷无水乙醇中退火，风干备用。2探针FISH探针包括双链DNA、单链DNA、RNA和合成的寡聚核苷酸探针。DNA探针可分为为四类：基因组探针,多用于区分种间染色体或染色体区域的基因组DNA序列；重复顺序探针，其目标顺序通常是染色体上不同部位的串联高度重复顺序；能够在某一条染色体的着丝粒区或异染色质区产生致密的杂交带；染色体文库探针（又称涂染探针），通常是用流式细胞仪从染色体悬液中分离分出染色体，或对分带中期染色体进行不同程度的微切割（microdissection），再经分子克隆或PCR扩增制备染色体特异性探针，主要针对染色体或染色体特异区进行杂交，用于检测分裂细胞中的染色体结构畸变和标记染色体；单一序列探针，其片段一般比较长，必须插入到粘粒、噬菌体或酵母人工染色体（YAC）中进行扩增，主要用于单拷贝基因基因家族的检测定位。探针标记分为直接标记和间接标记。直接标记就是将荧光素直接与探针相连。间接标记法是先在探针上接一半抗原、再用能同半抗原特异结合的带荧光标记的蛋白对其进行检测。标记方法多用缺口平移、随机引物标记和PCR扩增法。3杂交把变性后的探针加到处理后的玻片上，37杂交1620，杂交完成后必须将游离的探针充分洗去。凉干后加适量的抗褪色液。4检测和显色检测方法包括直接荧光法和间接免疫荧光法。如用荧光染料直接标记探针，可直接置于荧光显微镜下观察；若探针是用一个半抗原标记的，则可通过间接免疫荧光法进行检测。用生物素标记的探针经常用FITC（绿荧光）、德克萨斯红或罗丹明（红荧光）标记的亲和素来显色观察；也可通过生物素化抗亲和素抗体夹层逐级放大信号进行检测，玻片还常用碘化丙啶（propidiumiodide，PI）补染，以便在荧光显微镜下观察杂交信号的同时，能看到胞核及染色体结构。（四）FISH的应用1在细胞遗传学中的应用传统的细胞遗传学研究技术存在固有的缺陷：需要大量的中期分裂相，由于在实体瘤中往往难以获得足够的分裂细胞，因此限制了肿瘤细胞遗传学的研究；必须通过染色体制备和使用显带技术，整个过程费时费力；敏感性较差，常规的染色体研究方法对于小片段易位、倒位、重复和缺失难以分析。FISH技术不仅可以应用染色体涂色方法检测间期细胞靶染色体数目变化，而且可以确定易位、重复、缺失或插入等染色体重排类型，为畸变染色体来源和断裂点提供可靠依据，并可鉴定环状染色体、双随体双着丝粒额外小染色体以及其它标记染色体。目前，FISH技术现已广泛应用于X、Y、21、13和18染色体数目畸变的临床诊断。2在基因定位和基因制图中的应用FISH是一种直接分析DNA序列在染色体或DNA上排列的分子细胞遗传学技术。其不仅可以以目的基因为探针，对中期的染色体进行杂交，确定该基因在染色体的位置；而且可以用于动植物基因组结构的研究和DNA分子物理图谱的构建。在FISH技术构建DNA分子图谱时，其分辨率决定了分子图谱的准确性和精密程度。以中期染色体为DNA载体建立起来的分子图谱称为染色体分子图谱。由于中期染色体经过复杂的折叠过程，将导致两个荧光探针间的分辨率保持在13Mb之间。应用细胞同步化技术制备的前期染色体可以将FISH的分辨率提高到175kb。DNA纤维FISH可以进一步将分辨率提高到1Kb，并与常规分子生物学的限制性内切酶图谱相近，但它具有更快速、更直接、更简便的优点。高分辨率的DNA荧光原位杂交技术能够快速准确地得到探针序列间的顺序、方向和真实的物理距离。2在基因诊断中的应用FISH技术是人类疾病临床诊断的重要手段之一。现有的高分辨分析方法不能检测诸如Duchenne/Becker肌营养不良、Prader-Willi综合症等存在微小染色体缺失的人类遗传病。FISH技术可以通过探针杂交，直观地观察到正常染色体存在杂交信号，而存在缺失的染色体无杂交信号，从而诊断缺失的存在与否。在血液病的研究中，特异的融合基因探针可以快速检测致病基因的存在，例如以ABL和BCR融合基因的cosmid克隆制备的FISH探针可以筛选Ph+病人；Y特异性DNA探针可以有效地诊断SRY基因等。二、染色体标本的FISH技术（一）实验目的1掌握FISH技术的一般原理，及其基本实验方法；2了解FISH技术的发展概况，以及应用范围。（二）实验原理FISH是以分子杂交为基础，应用非放射性荧光物质标记核酸探针，通过碱基互补的原理与靶DNA杂交，在核中或染色体上显示靶DNA序列位置的方法。FISH技术可分为四个步骤：样品制备、探针标记、杂交及其检测。（三）实验准备1材料染色体标本或血涂片2试剂甲醇、乙醇、乙酸、标记探针（生物素标记探针或地高辛标记探针）、3mol/L乙酸钠、甲酰胺（分子生物学级和粗制品）、杂交缓冲液（4SSC，20%硫酸葡萄糖）、鲑精DNA、磷酸钠、Tween20、BSA、检测液（5g/ml荧光素偶联的亲和素或6g/ml罗丹明偶联的抗地高辛抗体） DAPI3仪器低温高速离心机、荧光显微镜、旋涡混匀器、移液器、恒温水浴锅、培养箱、烤箱（四）实验方法与步骤1探针混合与变性（1）混合2060ng标记探针DNA和35g鲑精DNA。反应后体积少于10l，可直接冻干；若体积较大，可加1/20体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积100%乙醇沉淀DNA。混匀并于-7030min。在4，12000r/min离心10min，弃