纯化水微生物限度.doc

纯化水微生物限度滤膜法微生物检测： 将适当孔径的滤膜放入滤器，过滤样品，由于滤膜的作用而将微生物保留在膜的表面上。样品中微生物生长抑制剂可在过滤后用无菌水冲洗滤器而除去。然后，将滤膜放在培养基上培养，营养物和代谢物通过滤膜的微孔进行交换，在滤膜表面上培养出的菌落可以计数，并和样品量相关。 滤膜法的优点： - 与直接法比较，可以检测大量的样品 - 浓缩效应使微生物检测的准确度提高 - 带有菌落的滤膜，可作为检测的永久记录存档 - 可见的菌落和样品量直接对应，得出定量结果 操作具体一点就是：薄膜过滤法检测，一个样过滤一份，就是200ml的纯化水通过滤膜，将该滤膜浸泡在灭菌好的l生理盐水中，再接种到平皿中，制成10级、100级、1000级稀释倍数的细菌、霉菌和酵母菌稀释培养皿，即可用平皿法检测纯化水的微生物限度 摘要：目的探讨平皿法检查纯化水微生物限度的可行性。方法采用中华人民共和国药典2005年版二部附录平皿法和薄膜过滤法同时时纯化水进行微生物限度检壹并作出比较。结果平皿法操作简便，菌落清晰准确可靠。结论平皿法检测纯化水微生物限度是可行的，尤其适用药厂、医院开展此项检验。 关键词；纯化水；微生物限度；平皿法；薄膜过滤法 纯化水为蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其它适宜的方法制得的供药用的水，不含任何附加剂。纯化水的优劣，直接关系到药品质量。中华人民共和国药典2005年版规定其微生物限度检查采用薄膜过滤法。并规定其细菌、霉菌和酵母菌总数每毫升不得过100个。由于此法操作较繁，滤膜较小(直径只有50mm)，菌落多时清晰度欠佳，影响计数的准确性。笔者采用平皿法进行比较，该法操作简便，菌落清晰，计数准确，效果较为理想。 1材料和仪器 11样品来源19批纯化水系辖区内7家制药厂生产的为微生物限度检查验证用送样检品。其中用 盐水瓶盛装的12个批次，三角烧瓶盛装的7个批次。 12培养基和仪器设备 121培养基：营养琼脂培养基批号050401，玫瑰红钠琼脂培养基批号050202，蛋白胨批号050523均为北京三药科技开发公司生产。 122仪器设备：开放式滤器(配以滤膜孔径045m，规格50mm)(上海医药工业研究院)；电动吸引器(上海医疗设备厂)；电热立式压力蒸汽消毒器(浙江绍兴医械总厂)；隔水式恒温培养箱(上海精密实验设备有限公司)；鼓风电热恒温干燥箱(浙江嘉兴电热仪器厂)；生化培养箱(广东医疗仪器厂)。 2方法 按中华人民共和国药典2005年版二部附录微生物限度检查。 21薄膜过滤法每批样品取灭菌薄膜过滤器2 套，每套分别加入样品lml及pH70无菌氯化钠蛋白胨100ml，经负压抽滤后，分别取出滤膜，菌面朝上，贴于营养琼脂培养基和玫瑰红钠培养基上，前者在35C培养48h，后者在25C培养72h，计数菌落。 22平皿法取原液和1：1O供试液各lml置直径90mm的无菌平皿中，注入1520ml温度不超过45溶化的营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基混匀，凝固，倒置培养，每个稀释级各制备2个平皿。培养温度，时间同薄膜过滤法。 3结果 19批样品经二法对比，15批吻合，其细菌数、霉菌及酵母菌总数少于lOO个，符合规定。其中4批差 异较大。 4讨论 41薄膜过滤法检测纯化水的微生物限度操作比较繁琐，除了过滤器需经灭菌外，负压抽滤的技术也相当重要，压力过大，滤膜易碎，如不抽干，取滤膜时供试液流失，都会影响结果的准确性。 42纯化水的制备达不到完全灭菌，加之有时储存过久或盛器未经灭菌，可能导致染菌较多。由于薄膜的直径仅50mm，菌落多肘，重叠情况严重，模糊不清，给准确计数带来困难，导致结果判断错误。 43平皿法是药典规定的检查不含抑菌成分且溶于水的供试品的常规微生物限度检查法，具有操作简便，菌落清晰度好等特点，用于纯化水的微生物检查应该在情理之中。我们认为平皿法尤其适用于药厂和医院制剂室开展对纯化水的微生物限度检查工作，值得提倡。 纯化水微生物限度检查方法验证方案一、培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基。改良马丁琼脂培养基、改良马丁培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基 二、菌种金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26003，枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) CMCC(B)63501，大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B) 44102，白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F) 98001，黑曲霉 (Aspergillus niger) CMCC(F)98003三、菌液的制备与计数1、菌液的制备：接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，置3035培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂斜面培养基中，置2328培养2448小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，置2328培养57天，加入35ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液。2、菌液的计数、分别取上述金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌10-5 10-7稀释液各1ml，加入平皿内，倾注约45营养琼脂培养基约20ml，每株试验菌各平行测定两平皿，3035培养48小时，计数，应约为50100cfu/ml。（分别取上述金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌10-5 10-7稀释液各1ml，加入培养皿内，倾注约45营养琼脂培养基约20ml，每株试验菌各平行测定两平皿，3035培养48小时，计数，应约为10100cfu/ml，作控制菌检查方法验证时使用。）、分别取上述白色念珠菌10-510-6稀释液和黑曲霉菌10-5孢子悬液各1ml，加入培养皿内，倾注约45玫瑰红钠琼脂培养基约20ml，每株试验菌各平行测定两平皿，2328培养72小时,应约为50100cfu/ml。四、细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证验证方法：验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的菌回收率。（薄膜过滤法）、试验组：分别取纯化水 1 ml，加入100 ml无菌纯化水中，再分别加入上述的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml）各1ml，用开放式薄膜过滤器过滤，滤干后取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的琼脂培养基上，每株试验菌各平行制备两个培养皿，细菌置3035培养48小时，霉菌及酵母菌置2328培养72小时，计数。、菌液组：分别取上述的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml）1ml，加至 100 ml无菌纯化水中，摇匀，用开放式薄膜过滤器过滤，滤干后取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的琼脂培养基上，每株试验菌平行制备两培养皿。细菌置3035培养48小时，霉菌及酵母菌置2328培养72小时，计数。、供试品对照组：分别取纯化水 1 ml，加入100 ml无菌纯化水中，用开放式薄膜过滤器过滤，滤干后取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的琼脂培养基上，平行测定两培养皿，细菌置3035培养48小时，霉菌及酵母菌置2328培养72小时，计数。、阴性对照组: 分别取100ml的无菌纯化水，用开放式薄膜过滤器过滤，滤干后取出滤膜，菌面朝上贴于制备好的琼脂培养基上，细菌置3035培养48小时，霉菌及酵母菌置2328培养72小时，计数。、回收率的计算：按如下公式计算试验组的菌回收率：试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数试验组的菌回收率= 100%