课件：闽福援输血安全与病毒感染.ppt

病毒感染与输血安全 北京佑安医院 闵福援,2,肝炎病毒感染率（中国）,1,乙型肝炎危害的现状,流 行 病 学 调 查： 1. 约70 % 肝硬化患者 HBsAg (+) ，82 % 有过乙肝感染史，仅有10-19 % 的病人与酒精性肝炎有关。 2. 80 % 肝癌与 HBV 有关（经病理检查），慢性乙肝患者肝病是阴性人群的 40 倍。 3. 肝癌称为 “癌中之王”，从患肝炎开始到肝癌发生中位时间约为 10 年左右。如经治疗，生存率其：,2,中国丁型肝炎感染状况,乙肝病毒合并丁肝病毒感染，80 % 患者转成慢性肝炎,3,丙型肝炎危害的现状,1-5%,死亡率,20-30%,丙肝肝硬化率,70%,丙肝慢性化率,4000万人,中国丙肝抗体阳性患者,1. 丙肝流行率 3.2% 。 2. 丙肝有 6 个基因型，有 70 几个亚型（中国 1b、2a 为主）。 3. HBV 和 HCV 重叠感染，发展成肝硬化和失代偿期肝病，发生肝癌的 危险性明显增加。,4,艾滋病自发现至今在全球肆虐，截止2003年底，估计已造成 6900万人感染，其中2700万人死亡。艾滋病在 1985年传入我国， 截止 2003 年底，专家估计我国现存活的HIV感染者约 84 万， 其中 AIDS病人8万。疫情已覆盖全国所有省、自治区、直辖市， 流行范围广，面临艾滋病发病和死亡高峰期，我国的艾滋病已由吸毒、暗娼等高危人群开始向一般人群扩散。,艾滋病（AIDS）流行状况,艾滋病诊疗指南2009.6,5,6,血清标志物与乙型肝炎病毒感染,7,包括 HBV 基因分型及 ccc DNA 检测，耐药变异位点测定,9,8,乙型肝炎病毒血清学检测的临床意义,10,（一）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg） 解 析,9,11,10,0 3 6 9 12,水,平,Pres1,抗原,HBsAg,ALT,HBs,抗体,Pre S1,(,IgG,),HBeAg,HBc,(,IgM,),HBc,(,IgG,),HBe,抗体,月,HBV-DNA,急性乙肝患者血清病毒学标志物转换曲线,免疫耐受期 免疫清除期 免疫控制期 免疫活动期,ALT,HBV DNA,HBeAg,Anti-HBe,慢性乙型肝炎的临床过程,11,13,急性HBV 感染：转变为慢性的风险与 原发感染时的年龄相关,12,14,急 性 肝 炎 患 者,13,EASL 指南 CHB 治疗的目标,治疗目标：是阻止疾病进展到肝硬化、失代偿肝硬化、 终末期肝病、HCC 和死亡，改善生活和生存质量 治疗终点：.理想的终点: sAg 消失 .满意的终点: eAg 转换 .次要的终点: eAg 未转者与 eAg 者 用 NUCs 维持 DNA 测不出 或用 IFN 后 DNA 测不出 EASL Clinical PracticeGuidelines:Management of Chronic Hepatitis B 2009;,14,对于 HBeAg 阳性和 HBeAg 阴性的患者,理想的治疗终点是实现 HBsAg 的消失( 伴随或者不伴随 Anti-HBs 的出现 ),背景：为什么需要 HBsAg 定量检测?,EASL Clinical Practice Guidelines: Management of chronic hepatitis B, Journal of Hepatology 50 (2009),HBV DNA = 病毒学标志,HBsAg = 免疫学应答标志,15,HBsAg 定量检测是：可做为肝脏cccDNA间接指标,16,HBsAg 定量：提示持久的治疗应答,Piratvisuth T., Lau GKK., Marcellin P., Brunetto MR. (2010). 20th conference of the APASL, Beijing, China,17,19,18,派罗欣治疗 24 周 HBsAg 定量的指导价值,32%,52%,16%,停药1年后的 HBeAg转换,24周HBsAg (IU/mL),20,000,1,500,1,500-20,000,19% (8/43),Lau et al. APASL 2009 Poster 083,在24周时 HBsAg 1500 IU/mL 的病人 ，51% 获得治疗后1年的 HBeAg 血清转换，其中 20% 获得 HBsAg 清除。,所有患者,19,21,20,22,SVRs (N=12),NRs (N=18),Relapsers (N=18),0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,Treatment,FUP,BL,W12,W24,W48,W72,W96,0,Log HBsAg IU/ml,在治疗之中 HBsAg 的降低可以鉴别复发和应答者,Moucari R et al. Hepatology 2009,21,HBV 感染的不同时期的 HBsAg 水平,IT: 免疫耐受,IC: 免疫控制,300,000,250,000,200,000,150,000,100,000,50,000,0,IU/ml,IT,IC,LR,ENH,Jaroszewicz, Cornberg et al., J Hepatol 2009; in press,22,HBsAg 定量的临床应用价值,Pegasys Nucleosid Analoges Inactive chronic hepatitis B carriers (not under treatment),支持的程度,发表指南 同行评议 KOL 支持 有价值的数据,可用,部分可用,尚不可用,HBsAg 定量可以用于 Pegasys 治疗的治疗监控和判断预后. HBsAg 定量 也许可以用于核苷类药物的治疗监控和判断预后 . HBsAg 定量也许可以用于未经治疗的非活动性慢性乙肝患者的监控.,23,结论： HBsAg 定量作为临床监测指标的重要性专家共识,HBsAg 的消失以及最终的血清转换是 CHB 患者可能达到的最佳 治疗效果。 HBsAg 的显著降低预示病人预后良好。 HBsAg 而不是HBV DNA是 Pegasys 治疗预后的良好的指示指标 通过 HBsAg 定量检测可以预测哪些患者最可能发生免疫应答， 并指导治疗方案的制定,24,26,（二） 乙型肝炎病毒分子生物学诊断,25,HBV DNA 定量检测 敏感度已达 5-10 c/ml 1个IU 相当于 5.4 基因组 拷贝数,HBV 基因 分型,HBV 耐药 突变 检测,病毒 前C区 和BCP 检测,乙型肝炎分子生物学诊断技术,26,HBV DNA 定量测定 是目前评价 HBV 复制情况的金标准。 血清定量 HBV DNA水平与传染性的强弱、疾病定性 和疾病发展、治疗方案和疗效判定密切相关。 3. 慢性肝炎抗病毒治疗的 HBV 耐药突变分子生物学 检测。,27,基因型耐药检测常用方法,（1）基因型特异性引物 PCR 法； （2）限制性片段长度多态性分析法（RFLP）； （3）线性探针反向杂交法（INNO LIPA）； （4）基因序列测定法等。,28,乙型肝炎病毒基因分型,29,31,聚合酶基因突变 核苷类似药物治疗耐受 主要为拉米夫定产生耐药性 以YMDD 基序的变异最重要,包膜基因的变异 前S 序列异质性最高 “a”抗原决定族 疫苗/HBIg治疗,前C区和核心区基因的变异 造成 HBeAg 的表达的减少或终止 HBeAg 阴性但慢性HBV感染 HBe 低浓度，2 x replication ,X 基因变异 影响病毒的转录和复制,30,32,前C/ A83 位点突变是HBV 最常见变异,HBV 前C nt 83 的G A（A83）点突变，使 AA28 由色氨酸 （TGG）变异为终止密码子（TAG）。 Pre C 区的基因突变是与 HBV 的感染 与 免疫以及 重症乙型 肝炎密切相关的一类突变。 抗 HBe(+) 慢性乙型肝炎，大多数是前 C/A83 位点发生突变， 突变株不能分泌 HBeAg，但 HBV DNA 仍为(+)，患者演变成 肝硬化机率较高。应用干扰素治疗后有较高复发率。 一些慢性 HBV 感染者常是 野生 和 变异毒株 的混合感染。 前 C/A83 变异者 有选择优势。可逃逸宿主的 免疫清除而使 感染持续。,31,33,HBsAg S-Gene 突变,疫苗逃逸突变株 T126S T131N M133L K141E D144E G145R 2. 诊断逃逸突变株 P120T/ A/Q D144A T131K G145R 3. 抗病毒耐药突变株 L195M W196S M198L,195,196,198,32,34,乙肝病毒（HBV）感染时相及相关指标,* 由于基本核心启动子区（BCP）或前C区变异引起的HBeAg低水平或无表达,33,（三）HBsAg 病原学特点及血液筛查的互补配对,表面抗原的病原学特点主要有 六 种人群,34,实验室血液筛查 HBsAg 互补配对,1. HBsAg 筛查对象,非活动性 HBsAg 携带者,慢 性 HBV 携带者,部 分 变异株,HBsAg（+） 不合格血,HBsAg （-） HBV MP-NAT检测,根据抗 HBsAg 病原学特点,35,2. HBV MP-NAT 筛查对象,急性肝炎 HBsAg 窗口期,隐匿性 慢性 乙型肝炎,HBV 变异株,单一 抗HBc,HBV MP-NAT(-) 合格血,HBV MP-NAT(+)再进行 HBV ID-NAT 血检测， （+）为不合格血,36,HBsAg / HBV NAT 互补配对重点提示： 根据 HBV 病原学特点，HBsAg 与 HBV DNA的不一致性， 两者不仅不能互相替代，其各自试剂的质量要求也是应该 很高的。 HBsAg 含量低或变异株等原因，HBV-DNA 含量也很低，造成 血液筛查双漏检是存在的，所以第一线 HBsAg 检测至关重要， 选择灵敏度检测变异能力，精密度，以及稳定性优于 ELISA 方法的电化学发光法（Elecsys）测定，更能达到 HBsAg/HBV DNA 配对组的互为补充加强的目的。使筛查风险降得更低。,37,（四）抗 HCV 病原学特点及血液筛查的互补配对,A.,（1）HCV 感染的潜伏期平均 50 天左右血清 ALT 升高， 约 1/3 无任何症状。,（2）HCV 感染后 1-2 周内血液即可检出 HCV-RNA；潜伏期后出现 临床症状时仅 50-70% ，血清抗 HCV 阳性，3 个月后 约 90% 抗 HCV 阳性。,B. HCV感染后的病毒血症可表现 3 种形式,注：后者在全部患者中占 3/4，提示病情持续进展，或已发展到慢性阶段。,抗 HCV 的病原学特点,38,急性丙型肝炎患者血清病毒学 标志物的转换曲线,慢性丙型肝炎患者血清病毒学 标志物的转换曲线,39,抗 HCV 血液筛查互补配对,根据抗 HCV 病原学特点,弥补检测一过性病毒血症 （HCV-RNA 转阴后）中 的抗HCV（+）者的血液,抗HCV（+） 不合格血,抗HCV （-） HCV MP-NAT 检测,窗口期外抗 HCV（+）人群 包括临床症状出现时和 3个 月后抗 HCV（+）者血液,弥补检测间歇性病毒血症 （HCV-RNA间歇性阳性） 的抗HCV（+）者的血液,1. 抗 HCV 血液筛查,40,2.HCV MP-NAT 筛查对象,窗口期 检测,HCV 感染后，血液中 检测不到抗 HCV （或者假阴性）， 但HCV RNA（+）,持续性 病毒血症 HCV RNA 的检测,间歇性 病毒血症 HCV RNA 的检测,HCV MP-NAT (+) 再进行 HCV ID-NAT血检测， （+）为不合格血,HCV MP-NAT (-) 合格血,一过性 病毒血症 HCV RNA 的检测,41,抗 HCV / HCV NAT 互补配对重点提示,根据 HCV 病原学特点，抗 HCV 和 HCV RNA 之间的不一致性，要求 第一线抗 HCV 和第二线的 HCV RNA 不仅不能互相替代，其各自检测 试剂的质量要求也是应该很高的。 抗 HCV 的 COI 值高低与 HCV RNA 阳性率相关性高。 HCV RNA 有漏检 和假阳性问题。 抗HCV不同厂家试剂 COI (+)值不能完全客观反映抗 HCV阳性状况以及 出现假阳性结果这与试剂本身的C33CNS3、 C22(p)CORE、 C100NS4、 NS5等区域的检出率有关，同时试剂的基因表达产物蛋白活性，纯度 需要进一步提高。,42,（五）艾滋病分期,43,抗HIV病原学特点及血液筛查互补配对,窗口期。 高度变异是抗 HIV 检测的难点。 少数晚期患者抗 HIV 亦可阴性。,HIV 自身的特点：,44,实验室血液筛查抗 HIV 互补配对,根据抗 HIV 病原学特点,1. 抗 HIV 和 HIV1P24 抗原筛查对象,对抗原血症和抗 HIV 合成受损的患者提高 识别率,抗 HIV 和 HIV 抗原 （+） 为不合格血,抗HIV 和HIV抗原 HIV MP-NAT检测,两者联合检测使窗口期 较单一抗 HIV 测定 缩短5-7天,测抗原使用重组RT抗原， 因其高度保守，可提高 检出变异株的能力,（-）,45,2. HIV MP-NAT 筛查对象,少数抗 HIV （-） 的感染者,HIV MP-NAT （-） 合格血,检测 HIV 血症和 窗口期筛查,提高检测 HIV 变异株的能力,HIV MP-NAT (+) 再进行 HIV ID-NAT 血检测， （+）为不合格血,46,抗 HIV + HIV1P24 抗原 / HIV NAT 互补配对重点提示,根据HIV 病原学特点，抗体的窗口期是血液筛查的最 重要的问题，HIV RNA 和 HIV1P24 抗原测定是优势项目。 HIV RNA 和应用重组 RT 抗原检测抗 HCV 是加强检测 变异株能力的优势项目。,47,49,48,50,49,（六）诊断试剂检测数据对比 （部分）,51,Elecsys HBsAg(电化学发光测定）与 ELISA 敏感度（窗口期）比较,与ELISA试剂窗口期相差平均40天。,50,52,国内外 HBsAg 诊断试剂灵敏度评估,国家参考品 adr 血清的检测结果,51,53,ECL与ELISA相比较的 分析灵敏度,52,54,ECL与 ELISA 相比较的精密度,53,55,54,56,抗-HCV国家参考血清盘评估,55,56,检测临床样本的特异性，未经选择的门诊病人、透析病人、孕妇，特异性 99.6%,检测 HIV 抗原具有良好的特异性,57,58,60,1/2,59,61,2/2,Elecsys HBsAg s/co 0.9 为阳性。A和C HBsAg s/co 1.0为阳性。B HBsAg 0.05 IU/ml 为阳性,60,62,2019/4/12,62,对于突变株无法识别也是漏检的原因之一,61,63,可靠性：高临床灵敏度并且能可靠检测 HBV 变异株,表3：HBsAg 检测的临床灵敏度。阳性样本已采用中和试验进行确认,62,64,不同方法对于变异的检测能力,63,65,Elecsys（R）与酶标试剂的主要区别,64,66,谢,谢,在 HBV 血清学检测策略中，增加抗-HBc 检测项目的必要性,1、HBV血清学筛查策略： HBsAg 阴性的隐匿性 HBV 感染者的血清病毒一般保持低水平 的复制，HBV DNA 含量低于 104 IU/ml5，甚至低至 110 IU/ml 16。隐匿性肝炎一般分为抗 HBc（）和抗 HBc（）两种类型， 在 NAT 和 HBsAg 基础上加上抗 HBc 互补检测是控制输血后肝炎的 又一个较好选择。,68,乙肝病毒（HBV）感染时相及相关指标,* 由于基本核心启动子区（BCP）或前C区变异引起的HBeAg低水平或无表达,2、国内HBV病原特征： 我国属于 HBV 感染高度流行地区，一般人群的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性率为 9.09%1 。2006 年，卫生部再次开展了全国人群乙型肝炎等有关疾病血清病原学调查，结果全国 159 岁人群中 HBsAg 携带率为 7.18%，据此推算，我国 HBsAg 携带者约 9300万人。城市与农村人群携带率差异不显著；西部地区人群携带率高于东部地区；1559 岁人群携带率最高，达8.57%2。由以上数据可以看出，在法定献血人群（1855 岁）中，仍存在较高的 HBV 感染率。 我国每年仍有少数新发输血后肝炎病例的报道，原因主要有以下4方面：于病毒感染 窗口期献血、病毒变异、不典型的血清转换（如隐匿性感染）及实验室错误操作等。我国 每年报道的乙肝新发病例约为50万3，其中由输血传播所致的比例尚待研究。 现有的血清标志物检测技术难以对OBI（Occult HBV infection，隐匿性 HBV 感染） 或单一抗 HBc（）人群进行准确诊断，一般 OBI个体血清中 HBV DNA 水平低，对 NAT 提出了较高要求，给进一步提高输血安全带来了新的挑战。国际输血协会正在进行采用 NAT 或抗-HBc 检测 OBI 的国际研究。这对于 HBV 感染率58.6% 的中国尤其重要。,3、 其他国家 HBV 血清学筛查策略： （1）日本模式：日本红十字会（Japanese Red Cross，JRC）血液中心从 1989 年开始，已 经将 HBsAg、乙型肝炎核心抗原抗体（抗-HBc）以及乙型肝炎表面原抗体（抗-HBs）的检测纳入到血筛中。日本红十字会在一项历时4 年的研究中4，对15721份样本进行了HBV ID （Individual donation）-NAT，确认了158 份 HBVID-NAT-only-阳性样本，占ID-NAT 检测样品的1. 01%，其中 95 份为低滴度的 抗-HBc 阳性。这一结果显示，在日本血筛系统下，重复献血者 60%的ID-NAT-only-阳性样本来自于隐匿性携带者。这些隐匿性携带者的病毒载量很低，78份样本中有75 份低于100 个拷贝ml。这样的浓度用混合样本-NAT 系统是不能检测出来的，需要发展和完善用于筛查的 ID-NAT 系统。研究显示：低水平抗-HBc 造成输血后肝炎比抗-HBc（）窗口期血液要低。但对高感染率的中国，抗-HB c的检测要比欧美等国更需要。 （2）美国模式：1986 1987 年间，在血源筛查 HBV 感染中，开始引入抗-HBc的检测作为补充。这十几年来，美国一直采用 HBsAg 和抗-HBc 化学发光法联合检测作为血源筛查 HBV 感染阳性的标准，输血传播 HBV 的残余风险在 1:488 000 1:205 0006。 （）世界胃肠组织临床指南建议：乙型肝炎血液筛查 HBsAg 、抗和HBV DNA 三项,建议讨论、论证： 欧美乙型肝炎低流行区，因“窗口期”OBI引发输血后乙型肝炎是主要原因； 中国是乙型肝炎高流行区（感染率 58.6%、HBsAg携带率约 8%），抗-HBc（+） OBI和单一抗-HBc（+）人群数量多，是引发输血后乙肝的主要原因之一。采用 NAT 可提高 OBI 的检出率，但是