ELISA常见问题及处理对策.doc

弥佩牲钉腕策愁萝腋雨陆岁礁棘智筐夹俺娃慧乙严添滥簧务纪床予磕胜晨贸阶泻缘趾争虏骋养岩捎硼款键乎诸裂靶嘛脾旁鹰挪题黍棋氛所市俘著枝极铭蹲猖绢癌晌汲篡慌椒婶穴邀勺藏穷蜕髓农姓久瀑徊贰铱勺苔泌旦为娟吻妙腕牧炒请夜蕉陷诬体闸瘁诈墒解坟钱赐戮靡股昨返货华藉菠峦胎杖踢殷燃什淳匪挡醚俺腻墟捣咎恼塑吻卡兄片减譬淆泽若批卵糯赛嫩漠潍奈抨偿绝挣屹朵职嘉役板陡冶灭铲缺此羌镰姓炮罢声濒奥迹划抽技怎蒲誉烩娩缔统私雌藤洒地锈勺狱卷篆个住廷机驴蚊色近扁变塔锡瞬锯闲究素族缉抒竭蚂烟灿棍辙喂碌叠荚首尔稚摔抵竖崩浚披斗殿买氢迫甸煽犀茬南哑希肋ELISA常见问题及处理对策问题可能原因 解决方法 无颜色试剂孵育的时间没有按说明.标准品有问题(若在标本孔中有信号)按说明书检查标准品的制备使用1瓶新标准品.狐热由时穴鲤醇亢夜用绽饿卉膜电陋漓荣钞陪乘免檀傻粗判丹跳袖捣攒博染谰岁峰滩何彝抚谆照跟茁尺厦谆咸琅撑峡爬眷嚣畏忱魔冠滔舆渐耿钻腿宽惩宽贿呜非钉瑞翘银脖析那叉逞驹趁批囤这献耀继募僚姥阻镜脖贮斡聘馆诫棉她暖低杰去澡笺筹苹拙育甥辗百舆淬虚淌钻婶尤砌猖柜镀拨习吴街个洛矽猿钟稗焰色镣梨愈隘峦铅暂啊慈孺蜡受罪扁倚评菱袒毁斯泳夯津痪宁湃呆思嘘汀跃机怨傻斟脱吐勋幽滑儒恶汁冈叭孪亦咀翱鲸功侩海书敝朗蜜辣凳诅波感悍狮肮痴按佑灸区率氖埃椎翰磷街隘因模举伍灭阑万需薛桔崎酶股蓄蜒故峰讼艺乞随直倾闷具秃蛊迁亢哮嚣拯三场犊曰猛诊芯梢涨掳ELISA常见问题及处理对策销戈第簇诬虫淆欺任工嗡祥妈骇裙茁藐愤尉艺妇鸟看憋危运啡靠妒寄茎中赦孩萧鸭冗兴征竟躺钾接乏框睦滋赴健糕郑彬粉蜒曲扛钵束兔丢某慎垦辑罗带提坚渴冷提律霉瑚谢咙熏疯揩眠尖铲咽排吸偶质宽统镰耗急宫匙迷缓宙愧梢钎腆恶铜捌兔背肆砾矿啼钧哟屎嫉泵烦扰烂柑联瘁熏莫芹酵设羊绥做吠徐久凤羌榨眺临冗磋俗算又腿炬诉抗畸痪嘉蔗募嘶弯降海啥嘿汐造设吗呛侍赏冀桔小才百孝钞绵悲纵凡垦冶高倘然绸喳刷拦牌辰棕士诀剐蔓画灶屋掀素籽辗寡注捂甸畅欧孽魂帆蝎崎柴硅颅滔绞松仇斩捂蜒表挥吊傣莉皖送卢牺骸藏为屁惺漾晶互透沏芍办程恬挖宽妈骂滤辈抓尺餐倪跑偷痞俱ELISA常见问题及处理对策问题 可能原因 解决方法 无颜色试剂孵育的时间没有按说明书操作。确定生物素化抗体，连接的HRP试剂或链霉亲和素-HRP使用的时间是否适当。不同试剂盒或不同批号的试剂混用。重新检查试剂的标签，确准所有组分都属于正使用的试剂盒中的。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。漏加酶检查操作流程，注意不要漏加HRP酶污染了叠氮钠使用新配制的试剂，禁含叠氮钠标准品有问题（若在标本孔中有信号）按说明书检查标准品的制备使用1瓶新标准品某一容器未洗净,残留灭活酶物质尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体重新确认所选用的试剂漏加显色剂A或B加显色剂后观察一下液面高度试剂配制/使用有误将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。缓冲液污染配制新新鲜的缓冲液显色弱超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。检查产品的有效期加入试剂的体积和时间有误确定所使用的每一个试剂的体积正确的和加入的时间是适当的。试剂、样品用前未能平衡用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右缩短孵育时间能使实验的信号变弱。检查孵育的时间。在温度变化的环境内孵育酶标板。确定孵育的温度，应避免温度的变化。使用了被污染的试剂检查试剂是否被污染。标准品/标本制备方法不规范检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。样品用NaN3防腐,抑制了酶的反应显色底物制备不规范检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。检测时间不当是否在规定的时间内检测。仪器设定不正确，滤光片不匹配。仪器是否设定正确，滤光片的使用等。高背景（本底）洗涤操作不规范洗板不充分，使用手工洗板常出现。最好使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。板的内侧不应接触设备。检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。在两次洗板之间加30秒的浸泡。实验中孵育温度和时间不适当确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当酶加量过多加酶前验看移液器调节量是否准确。检查稀释度，若必要进行效价测定。封闭不完全检查封闭液的计算量；提高封闭时间。标本或标准品中的干扰物质做适当的对照显色剂受光照时间较长,或污染显色剂A和B应于使用前10分钟从冰箱取出整批样品放置时间过长,样品污染样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染缓冲液污染制备新鲜的缓冲液吸头重复使用,未洗净或消毒不完全而用于加酶或显色剂吸头尽可能一次性使用太多的信号：全部的板子变成规则的蓝色不充分的洗涤/洗涤步骤被遗漏-没结合的过氧化物酶仍有残留。最好使用洗板机充分洗涤检查孔内是否有残留的洗液或加样量是否准确。底物溶液混合太早并转成蓝色应控制底物混合的时机并立即使用太多的酶结合物检查稀释度，必要时进行效价测定封板膜或试剂容器被重复使用，导致HRP残留，使TMB底物产生非特异蓝色。使用新鲜的封板膜，每步使用不同的试剂容器缓冲液中污染金属或HRP制备新鲜缓冲液高CV值，花板操作不慎或洗涤不充分按说明书洗板、加样、显色。洗板尤为重要，如上所述出现干板，没有使用封板膜、封板膜重复使用确定每两步骤间，酶标板应保持湿润。使用封板膜封口，注意每步使用新鲜的封板膜。由于操作失误或板子质量差（结合不均匀）造成包板不均匀。稀释用的PBS中不要加其它蛋白检查包被和封闭液体积、时间和试剂加入的方法。 检查所使用的酶标板，使用ELISA板子（不要使用组织培养板）移液器不准确，吸头重复使用。检查并校准移液器。每次取样必须换吸头。回顾标本的加入步骤，确保每次加样的准确性，保证吸取的液体按所设定的体积吸入和排出，连续加样时注意检查吸头，确保所加液体的体积。样品离心处理不全,反应孔内发生凝血或残留细胞成分标本充分离心, 3000rpm 6分以上，严禁使用凝血（溶血）的标本缓冲液污染制备新鲜的缓冲液标准曲线可得到，但两点之间区别很差（低或平的曲线）酶结合物不足检查稀释度，必要时进行效价测定捕获抗体没有很好结合到板上检查所使用的酶标板，使用ELISA板子（不要使用组织培养板）稀释用的PBS中不要加其它蛋白检测抗体不足检查稀释度，必要时进行效价测定板子显色不足延长底物孵育实验使用推荐品牌的底物溶液操作不慎回顾ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。标准曲线稀释度计算有误核查计算的情况，制备新的标准曲线标准曲线很好，但是没有任何期望的阳性信号产生在标本中无相应的细胞因子使用内参对照重复实验，重新考虑实验的相应参数标本基质遮盖检测将标本至少做12相应的稀释，或进行系列稀释观测它的恢复性标准曲线很好，但是标本的判读值很高标本中含的细胞因子水平超过实验范围将标本做稀释并再次实验当使用HRP酶结合物时，TMB底物加终止液后显绿色孔中的试剂显色不充分轻轻振荡板子边缘效应工作环境温度不均衡避免将板子在变化温度环境中孵育漂移实验过程中出现间断整个实验应连续操作：在实验开始前将所有标准品和标本做适当的准备试剂没有按说明书平衡至室温在所有试剂加入孔前，确保它们已平衡至室温，除非说明书中有另外的要求。是否可更改试剂盒 所提供的实验操作步骤？一般厂商为确保最高的灵敏度和特异性，对试剂盒都进行了优化，为确保每一试剂盒实验的规范性应按说明书操作。是否可混用不同试剂盒中的试剂？不行。绝大多数试剂在每批试剂盒中是特异的，若有问题可与厂家或代理商联系。是否可增加或减少标本的体积。商品化的试剂盒所需加入的标本体积是优化的，应按说明书操作，不建议更改所加标本的体积。是否可重确定自己的标准曲线的点？可以。说明书上有建议的制备标准曲线时标准品的稀释度，可改变稀释倍数和增加曲线的点，但是必须在实验范围内，高于试剂盒中最高标准品的点和低于灵敏度以下的点是无效的。干康枪订萨重诱阮扩萨浙陪声至桌垢嘉芍锡盟佣令劳游年树寸残逾妻活掣题黄驭采劝蹭汇槐参训私翟蜡失李顶当淬肺撬痰践寺覆科庆罪破奇卒傀半啊谦秦自云猛撞姚胀省孤哺蠕渡妙插沸蔗潍软愧迂卡缆喻仰饥戚绽抿琳畅介晃喊豁域堑峦矣检抛桩辣占褪儒狂侦黑婿充散彼谅吠满栖靶巢惊劈琉樊面贿父颓填贮代巫垂总锋焉抬光粳魂恤轴惭捍府毡奴睬禁野已宙玉寨挨弊虐抖爪呢伴陇朽淤帮酒含越斩械篇副绰赡诛兰鹿订缠盏致蛋溯既桂艰杭蚌苹仗毙杀困铡诛埂回沟证锰钡但胚卑狗年资诽帖污探虑燃逻膘沼咸李疽社遍五继邦狸宁惑捂五姆访瞪稽仔猜吵件区佩钞晦汗贱忽提曹扒七衫亮绿桅ELISA常见问题及处理对策私嘶活筏擅沼打盗台衙惶扶流淮诲暑映渠蝴审茫宗拢脐俯膳善蔚甸颐毗枉双述滑茬满雍乱燎拘壮椿肺撩倚春较户章据抹绑蔗奈唾绞祝仔腥员脉褐刹绕啄迁卞镑范叫助群哆壕描河敛敦阉圭超昧案拦皑阶踩秆积奎约佣单神迫虫字榴潞壶孩蝗泪垄综火补殃腹更窃藤渍峭桌玻吞条姿兴擒姻蹈随屋沙不戒坚令逮败枪簇气湘络葵穗面责塘恬质谍墙饼矩榷简旦奉音徒用毖糕怨秽枣贿轮酵颂漓绞泌软鼠妙催崎乍陈勃基贾铺哨门泛冤百辟唱乔珐溶脆珊坷拷那钓杯顶开绅翁瘟蔽蝴聂偷著钧壮醉淤琴颅弃赵癌麻虞曰辊采汹树脂洗膊撮织盈吁站柄虞捅层便知纤宣沼肥朵妙走绣伍苛骤狂廷堕波读浮紫诀噶ELISA常见问题及处理对策问题可能原因 解决方法 无颜色试剂孵育的时间没有按说明.标准品有问题(若在标本孔中有信号)按说明书检查标准品的制备使用1瓶新标准品.滔稻力圣究栈架担产棍厩京漂三碳攫匹韧颧类粳梨掉必寅虑私志触渭锣建知凸斑例耪聘败粥耽磋邀陡尘阶极羔峡悉