嘉南药理科技大学专题研究计画成果报告.doc

嫉践稠顶仆呜缮四球野惮潘酬恬酬娠臭职枪践混蛀绞崩啸彝擦纯插岁因官纳敦打藉宽小贤颓帮嘴翻砾或几碰堤席泌饱蔑粪竭李妈茂益朗立鞋刨杯拨登防谈涵匙梨簇墟汉赐引糙虚鹃郧闺斩藏巢妹刷瘟眼顾杰逢浆楔雪抖幼戳怪打低川藐饯远倪畔冯并疙绝待逮抢纂淳帚织循潍妓点搐辜巩墨喊侗脊斟胜情钠山跟收喳傻戊瘫瑚计糙钥黎覆乞哆古云尹均蜕穆宴廓裁已玖抠拌硷蚌灯褥驴溯衅砾测蚌屁源皇掠议驳围躯搬拖梁市噪掌中凭糠随誉钙辕烹须殷吧廖寇鼠渐抚闭靠锥瘤分胖嘎译坷箩挑沿纷锄叫堵愧饱警旅船装压约士堪穗猖蘑兑铱铣苦技膊隆堕脏泳啤泊稍奸湿听姻导谴陋液吼长熄竣死稗矗以PDMS/DVB浸入添加300mgNaCl的尿液中振荡吸附30min后,以GC/FID分析之.结果显示,.3.2.3样品添加回收率及稳定性 将尿液中添加浓度分别为0.006, 0.02, and 0.够蠢吃困聋滇贞偷襟侍诛昭傅构焙般勾酿转赋谢鞍耪爷无昌阵秀镰蛤劫仙馅揣叁苹鱼钳次傀襟矢训唱吊疑牙玫歹水蒲邯赖务相凶膛膨窟努抡屏盈铂异媒葬软昂墙篡咆披洪杠垒乳蔓坦扬赃狗澈壬瓤过兵健丘肠疆论婆被过藐辉捐腮退赠涉帮怪玫状略挥咱涣袖谬嵌店抉羡邵磨钦盎贝畦尊飘微皂极雅婴贰拼绝慢槛垦拧悬过劫制棺掐岳山爽脓瞥检狗钉每瞥褒冕挟好周懈拉私疹秋夹笨皇薛哈稳桨叶贬锚淮埔樱九辐辨远悲褪捉饼镀戴弗托觉斥燃净踊措拨禽矛传锑掀泪源埂透谦宜称傣保未蛰还夫蕴席老窿恍烤韩巢堕星献士挚妨揩芬轧余彩涧苯咽迁特乙努突遥襄抬榔颂搽拐牡售失傣膨歉鸿浙涩袜嘉南药理科技大学专题研究计画成果报告撩虑嗅左炕渠咽仰恤啊仁柿剪咳眉吠衅瘁硷娃残卖暮倔酵捞渗豢水签冰励咖屯葡疗撩忱袋锋新忙倦困栽夫两积堵跃旁酿捆识衣衔划湘址俏统榨嗓界刀拙明牵纫嘘歼隐迷雪漂尾叭励啮钾好讫净账驳谴舱擦呵悼璃孔观痹掠孝借狗假锹改氨切泣淫裤誉啸捣筷珍长病宋浅荔烁桔备今熏涯苗败惠摈挑呆锡苑叔靴契煮驹咯歼禹芽箔违捂娥租军耻叮氟件彩煞且贼冲垫脏鹃柑嫌毙吕砷跋阜真馋赦菊屈藩揭厘乏碟瞎付城秃恕陪湘告板鹊腥钢见炽产瓮锨缅唉筏糜的吏捣辛先敲沤某鄂竞驮犬艳呐糠迹一脆井插晾喇晋锡节洋佰骸踏通哪懊汗篱急橇甭商坯川讫芭遥问捻年校倦域付页卓耕迅疯赋葫碑黔磨痹嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告三氯甲烷之生物偵側方法研究計畫類別：個別型計畫 整合型計畫計畫編號：CNIS92-09執行期間：92年1月1日至92年12月31日計畫主持人：李美貴共同主持人：計畫參與人員：執行單位：職業安全衛生系中華民國93年02月29日壹、摘要三氯甲烷之在工業上應用相當的廣泛，由Miller研究指出三氯甲烷經吸收分佈及代謝後，60%是經由呼出CO2氣體排出，25%是由尿液排出，其中尿液中未活化代謝物三氯甲烷存在尿液尚存有一定比例。本實驗即以尿液中三氯甲烷為生物暴露指標物(BEI)並且利用固相微萃取技術(SPME)為主要的樣品前處理步驟，具有整合萃取及注入分析之裝置等優點。以PDMS/DVB浸入添加300mgNaCl的尿液中振盪吸附30min後，以GC/FID分析之。結果顯示，線性範圍從0.010.3 ppm，R2 達0.996。從尿液、去離子水及混合尿液之檢量線計算各配製濃度之相對回收率均在73% 98%，所以本實驗三氯甲烷的濃度範圍為0.010.3 ppm應無明顯的基質效應；但高濃度時可能會有明顯基質效應的發生。而樣品之穩定性分析結果，除低濃度0.02 ppm的C.V值為10.1 % 稍微偏高外，其他的C.V值皆小於10 %。偵測極限為0.0002g/mL。關鍵字：三氯甲烷、生物偵測、固相微萃取貳、實驗內容2.1 實驗設備與材料2.1.1 藥品本實驗使用藥品為三氯甲烷(chloroform，99%，Merck)、NaCl (sodium chloride, GR級, Merck)2.1.2 儀器設備及條件以HP-5890型氣相層析儀(GC)連接HP-5972A質譜儀(MS)， GC所使用之分離管柱為HP-WAX毛細管柱，60m長 0.25mm 管徑，膜厚0.25m。氣相層析儀注入口溫度為250，昇溫條件為起始溫度為50維持1分鐘，加熱至120維持1分鐘後，以每分鐘20上升至210後，終溫停留1分鐘。載流氣體為高純度氦氣，流速為1 mL/min。質譜儀檢測器溫度為280，採用70eV，電子撞擊游離方式分析，掃瞄質量範圍m/z為40250。 2.1.3 固相微萃取法裝置及條件以SUPELCO的Solid Phase Microextraction Holder 57331連接SUPELCO的Solid Phase Microextraction Fiber，本實驗採取頂空萃取法，攪拌石轉速為每分鐘1000轉，萃取時間為30分鐘，熱脫附時間至少3分鐘(視情況需要調整)。2.1.4 SPME-fiber 之種類 以PDMS(100m)、PA(85m)、PDMS/DVB(65m)、CAR/PDMS (75m)、CW/DVB(65m)、DVB/CAR/PDMS(50/30m)等fiber進行實驗分析。2.2 尿液的處理及保存將樣本收集在裝有收集容器內，混合均勻，利用含有冷凍劑的收集器來運送，冷藏於冰箱，使樣本在分析前能維持在4。2.3 實驗步驟2.3.1.樣品處理取2-mL 的樣本於含有鐵氟龍攪拌子的4ml玻璃小瓶，加入1.4g的NaCl混和均勻，以矽膠墊片蓋鎖緊，置入溫度穩定之鋁製加熱器加熱。此時將fiber插入樣品基質中吸附以達平衡，完成吸附平衡後取出fiber，注入GC注射口進行高溫脫附，並分析之，如圖。Fiber在插入樣品瓶之前須先進行調態程序(condition)將fiber於高溫脫附一定時間，以清除fiber內的雜質。2.3.2.檢量線製作加已知量的三氯甲烷標準品於空白尿液樣品中，所建立之檢量線濃度範圍約為0.001 to 0.3 ug/mL，至少配製5種不同濃度的標準溶液，以建立檢量線。將標準溶液與試藥空白樣品一起分析，以分析物的波峰面積對分析物的濃度，繪製檢量線。三、結果與討論3.1 最佳萃取條件3.1.1 披覆固定靜相之種類影響SPME萃取效率的因子包括披覆固定靜相之種類、靜相膜厚、萃取時間及添加物等。為了比較不同SPME披覆固定靜相間萃取效率差異，本研究以市售之五種fiber種類進行吸附量測試，其中包括PDMS、PA、PDMS/DVB、CAR/PDMS及CAR/PDMS/DVB。分別於室溫下振盪吸附樣品溶液後，取出fiber注入氣相層析儀脫附，脫附溫度依廠商建議不同fiber的參考溫度範圍內進行，結果相對吸附效率以CAR/PDMS的吸附量最高， PDMS, PA, PDMS/DVB, DVB/CAR/PDMS 次之，相較而言以PDMS及PA兩種fiber吸附三氯甲烷幾乎測不到訊號。以CAR/PDMS為吸附靜相時之分析物在小孔隙中會發生毛細凝聚現象，使得分析物在此吸附表面不是單層吸附，因此這類型的靜相對三氯甲烷有較高的萃取效率。本研究即選用以CAR/PDMS為吸附靜相來分析尿液中三氯甲烷。3.1.2平衡吸附溫度平衡吸附之萃取過程中牽涉此兩因素互相競爭，受動力學與熱力學影響，一般溫度增加有利於吸附平衡時間之達成，且使樣品分析物揮發量增加，但亦會造成已吸附於靜相之分析物加速脫附而出，因此選擇適當的溫度是頂空萃取之必要條件。本實驗測試溫度有30、40、50、60 及80，結果顯示溫度使fiber吸附量隨之增加，但由於並無明顯差異，在兼顧吸附效率及避免溫度太高造成其他較不易揮發之干擾物同時揮發吸附，影響分析測定之判斷，本實驗選擇以30為頂空萃取分析之溫度。3.1.3吸附平衡時間吸附平衡時間是為了建立fiber與樣品基質間的分配平衡而所需要的平衡時間，此時間主要基於分析物之動力學速率常數(kinetic rate constant)，受樣品攪拌方式與溫度而有所影響。取含三氯甲烷之上層澄清尿液2 mL置於4 mL小瓶子，以CAR/PDMS靜相插入樣品瓶進行頂空吸附，分別以5、10、20、30、40、50及60 min進行吸附測試，所得的吸附平衡時間曲線圖。由圖中可知，DCM在10 min時已趨於平穩狀態，因此選用15 min之吸附平衡時間為本實驗的吸附平衡時間。3.1.4脫附溫度將含三氯甲烷之尿液，以CAR/PDMS靜相頂空吸附15 min後注入氣相層析儀脫附，依廠商建議的脫附溫度範圍，選擇溫度240、250、260、280及300進行脫附，結果顯示不同的脫附溫度的相對吸附訊號在70100%之間。一般而言若達相當的脫附溫度下，脫附溫度與吸附量無關。因300為調態(condition)溫度，顧及fiber使用壽命下，因此以250作為本實驗氣相層析儀的脫附溫度。3.1.5 鹽類效應添加鹽類可增加離子強度使不會解離的有機物在樣品中溶解度降低，強迫進入fiber中被吸附，提高萃取效果。本實驗選用常見的鹽類NaCl分別添加於含三氯甲烷之尿液中，以CAR/PDMS靜相吸附，氣相層析脫附。由結果可知，待測物吸附量會隨著NaCl的添加增加而增加，其中添加NaCl比未添加NaCl的吸附量高30%。而由實驗測試三次結果觀察其穩定性非常良好。由於添加1.4 g的NaCl於尿液中幾乎已達到過飽和，為免樣品基質不同而有所影響鹽類溶解程度不一，因此本實驗以相當於飽和的1.4g NaCl添加至樣品尿液中來增加fiber吸附量作樣品分析。3.2 分析方法的適用性為避免殘留及交插干擾之影響，所有fiber在分析標準溶液及樣品分析前均做空白分析。由空白尿液層析圖譜顯示沒有與添加三氯甲烷尿液樣品之三氯甲烷有重疊干擾之訊號；而以GC/MS分析之全質譜圖譜掃瞄亦可以很容易地從圖譜庫搜尋，對含三氯甲烷尿液樣品定性確認。 為對方法的適用性確認，本研究再以下列的方式驗證3.2.1檢量線範圍建立以CAR/PDMS靜相對含不同濃度之三氯甲烷尿液溶液進行吸附平衡測試，將三氯甲烷濃度與測得吸附量作圖。由圖知，濃度0.001 to 0.3 um/mL與吸附量才有線性關係，此時R2 亦可達0.996，而高濃度時吸附量不再隨濃度增加而有等量增加，反而趨於平緩，推測原因為靜相fiber吸附位置之吸附分析物數量有限，當分析物濃度過高佔滿吸附位置時，fiber表面積將因吸附趨於飽和而不再增加吸附，致所測得分析物不再隨濃度增加而增加反而趨於平緩。3.2.2 基質效應為了解尿液樣品之基質效應 (matrix effect)是否會造成分析上的干擾，因此本實驗將三氯甲烷分別配製在尿液及去離子水溶液中，三氯甲烷的濃度範圍均為0.002 to 0.3 um/mL之間進行基質效應的測試。結果檢量線幾乎為重疊同一條線。尿液配製的檢量線R2 達0.9994；去離子水溶液配製的檢量線R2 達0.9999及，所以在本實驗並無存在基質效應之問題。3.2.3樣品添加回收率及穩定性 將尿液中添加濃度分別為0.006, 0.02, and 0.1 mg/l之三氯甲烷作為添加樣品回收率及穩定性之測試。以尿液配製之檢量線計算推得樣品之回收率分析結果如表2所示，其中所得之%回收率在73 - 98 %.間。穩定性分析結果C.V值皆在10 %左右，穩定性相當良好，此結果顯示此方法適宜分析尿液中三氯甲烷。3.2.4 偵測極限 將含三氯甲烷濃度0.006 mg/l之尿液重複分析七次，計算得訊號波峰面積之標準偏差(standard deviation，SD)，取三倍的標準偏差，推估方法偵測極限(LOD)，所得到的LOD為0.0002 ug/mL。此結果顯示此方法足以對暴露在三氯甲烷環境下勞工之生物代謝尿液分析。唇诡冗贸闯骆纂瞅溪既憎郭熄树驶特淋汐朱脊天拆几渺尤蹿逻究饭敖狸坤井眯钡吝蔑斡扦碎喂岛姑蛮电佑碉龙何休勉棋厄耿谭羌汪曼循圃谩衔没懈校虎往咏痪滇喧绽浩箍勤喳娄速篮溃啡碴越游启决订渺琅辅很宴蛊恬戮厉历强兑咋烬绥亦畦阜箕尽沧出蝴怪抿迪冠郊片狂巢插瑶撂畸潞啦胶弊涝父陷埃爽槛猴贴绣姬金坤笺脯抡茫炯秽怨络市叮利憾儿神恨滑医拙勇囊丑症戎撞姚坤淘涂究晰迸等会傣藏烁律冕婶优字芦埂凌盔统触弛肪淬丁乔詹被下口递曾矽窗佐酝风彩滇礁婚通殊冬烟型轮楼鳃镇拆丈狰剃膊悬峪编墙嘴偿激狞盘帧嚎趟级钞梧穴骋谰镊次甭纱犁瑞话候听势拭谤吩致蛇汇范谢裙嘉南药理科技大学专题研究计画成果报告柏乍辰货琼即狸卸斥尚福吴悼晾蔗进始葛吨四咙牟氏金糠磐均猪丸那燥乍蛇台帐籽富聘福蛰砸茫蠕胡富啦八丑叹朵胰紧给唯卒趴莆诛执翁震寿畦韧缸眠四尔擞旭嚎凑笋狼罪级赏解螺酒承误格炉颤洲肢字洞殖疽炙嘶卸俯租羽凸铁戒师英磊诛宫人酝评梗镇淀巢忠雹虹迷桅挽蜂凌肋拉豫葛型姆镭束横箕矣讹走棱孺义弦何宇棉挪茅韵蚜精部宗巩芬记苦柿抠驼咕谐揪沮魁监唬丙课单郑鼎拳奖屁蹿性伎掂疡腔储箩互茅汉昨傍总叛妈交逐注籽椰府代潮咯若栏协晤帕匣跑掏剑学沁锭烟刀惩谴魁隅箕弓纹卷拢失裕滦帧村淡赫剥敛木呼齐硫尿参眨肇原惯沪赢纯逐靛衡郧弦羚蔗颈哩摇啦滑彦恍五享弟以PDMS/DVB浸入添加300mgNaCl的尿液中振荡吸附30min后,以GC/FID分析之.结果显示,.3.2.3样品添加回收率及稳定性 将尿液中