课件：发病方法机制与主要研究方法.ppt

阻塞性肺气肿的发病机制,正常,正常,COPD,阻塞性肺气肿，是气道远端部分膨胀（包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡）并伴有气腔壁的破坏、肺弹性减退及肺容量增大的一种疾病。,蛋白酶,蛋白酶抑制剂,CD8+ 淋巴细胞,吸烟 O2 / H2O2 / HO,肺泡巨噬细胞吞噬功能下降 嗜中性粒细胞化学趋动因子 白介素 （IL-8），T N F - 介质（LTB4）,嗜中性粒细胞,嗜中性细胞弹性蛋白酶 组织蛋白酶 基质金属蛋白酶,-抗胰蛋白酶 SLP1 TIMPS,肺泡壁破坏 （肺气肿）,发病机制,树突状细胞,破坏弹力纤维,气流受限,粘液分泌增加,纤毛运动减退,反复感染,气道慢性炎症，气道重塑,发病机制, 气道炎症 氧化应激 蛋白酶/抗蛋白酶失衡 自主神经系统功能紊乱（如胆碱能神经受体分布异常）,气道炎症,COPD中的炎症细胞 树突状细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 T淋巴细胞 B淋巴细胞 嗜酸粒细胞 上皮细胞 成纤维细胞,参与COPD的炎症介质 趋化因子： LTB4 吸引中性粒细胞和T淋巴细胞 IL-8 吸引中性粒细胞和单核细胞 前列腺素 致炎因子： TNF-、IL-6 放大炎症反应 生长因子： 转化生长因子- 诱导小气道纤维化 MCP-1. GM-CSF . ET-1. PAF 等可能参与,COPD: 以炎症为核心的 多因素构成的疾病,炎症细胞数量/活性增加 促炎转录因子.核因子-B（NF-B） 炎症介质水平升高: IL-8, TNF-, LTB-4 和氧化剂 引起蛋白酶/抗蛋白酶失衡,杯状细胞增生/ 化生 粘液腺肥大 平滑肌质量增加 气道纤维化 肺泡破坏,营养状态差 BMI降低 骨骼肌损伤 虚弱无力,失去肺泡附着 弹性回缩力丧失 平滑肌收缩增强,粘液分泌过多 粘液纤毛运输减少 粘膜损伤,氧化应激,香烟烟雾和其它吸入颗粒能产生氧化物：H2O2 ，脂质过氧化物，CO ,NO COPD患者内源性抗氧化物产生下降 COPD患者呼出气浓缩物、痰、血中氧化应激的标志物（如过氧化氢和 8- isoprostane）增加 血浆抗氧化能力下降 氧化应激对肺组织的不利影响 激活炎症基因 使抗蛋白酶失活 刺激粘液高分泌 导致糖皮质激素的抗炎活性下降,蛋白酶/抗蛋白酶失衡, COPD患者肺组织中分解结缔组织的蛋白酶和 对抗此作用的抗蛋白酶之间存在失衡 弹性蛋白是肺实质结缔组织的主要成分，蛋白 酶引起弹性蛋白破坏，是导致肺气肿的重要原因，并且是不可逆的 肺气肿的形成主要与由巨噬细胞及其源性的基质金属蛋白酶起主导作用,COPD病理学特点,气道 炎症,粘膜纤毛 功能障碍,气流 阻塞,气道 结构 改变,炎症细胞数量/活性增加: - 树突状细胞 - 巨噬细胞 - 中性粒细胞, - CD8+ 淋巴细胞 IL-8, TNF, LTB4提高 粘膜水肿,肺泡破坏 上皮增生 腺体过度增大 杯状细胞变形 气道纤维组织增生,粘液过度分泌 粘液粘性增加 减少纤毛转运 粘膜损伤,平滑肌收缩 胆碱能释放增加 气道高反应性 弹性收缩降低,一、肺脏的变化,肉眼：肺脏过度膨大，失去弹性，灰白色。,镜下：见肺泡壁变薄、胀大，破裂或形成大泡，血供减少，弹性纤维网破坏,气道重塑，管腔变窄。,一、肺脏的变化,气道改变,二、肺血管、心脏改变,小血管管腔变窄、闭塞。 后期发展成肺心病时有右心改变。,通气功能障碍：肺顺应性，RV，FEV1，MVV，最大呼气中期流量 。 换气功能障碍：通气/血流分布不均匀,三、肺功能变化,COPD主要研究方法,小鼠 COPD 模型建立方法 小鼠肺功能检查 血浆、BALF 中细胞因子的 ELISA 测定 肺组织的免疫组织化学分析 待测标本的收集和处理 气道、肺组织病理形态学分析 蛋白电泳wester blot 琼脂糖凝胶电泳 RNA的提取及测定和Q-PCR 小鼠气道上皮细胞的提取与培养 小鼠腹腔巨噬细胞的提取 细胞培养基本技术胞培养基本技术,.,小鼠 COPD 模型建立方法,将小鼠随机分为COPD模型组和正常对照组，模型组（cigarette smoke exposed groups，简称 CS 组）小鼠每天熏烟两次，每次2 h，香烟剂量为10支h。两次间隔时间为3-4小时）正常对照小鼠（normal control groups，简称正常组）不作任何干预，各组大鼠在相同环境下自由饮水和摄食模型制备期间，每星期称量一次体质量，每个月检测一次小鼠肺功能。对照组小鼠不做任何干预。熏烟满6个月后，行肺功能检测、气道、肺组织病理形态学分析 、蛋白的检测、血浆和BALF 中细胞因子的 ELISA 测定、肺组织的免疫组织化学分析（熏烟装置包括熏烟箱；通风装置；和监测熏烟箱内的温度，湿度，和气体（氧气，CO）浓度监测装置。）,小鼠肺功能检查,烟雾暴露停止后，使用小鼠肺功能仪检测小鼠肺功能，测量吸气峰流速（PIF），吸气阻力(RI),肺动态顺应性（Cdyn）等，具体步骤：1%戊巴比妥（0.1ml/g）腹腔麻醉小鼠.固定、备皮、消毒后剪开皮肤，轻柔钝性分离暴露气管，在甲状腺处剪开气管，插入气管插管，放入体描箱，并连接小动物肺功能仪进行肺功能测定，潮气量（10ml/kg），吸气压力8-12cmH2O。呼吸120次/min，吸呼比10:15.待小鼠与呼吸机完全协调后，测定肺通气功能。记录数据, 为保证肺功能数据质量,操作均由同一人进行.,小鼠肺功能评价,小鼠血浆的收集和血细胞涂片的制备,经小鼠眼球取出血液。抗凝血（枸椽酸钠抗凝）平衡后，在 4以 1500rpm离心 10min，将血浆分装后，-80保存备用。将 0.5ml 血细胞装于 15ml 用 3ml 双蒸水室温下悬浮二次（70 sec、30 sec）立即离心（条件同上）, 倒除血红蛋白等成份后, 将细胞悬浮于 1ml 培养液中(MEM, DMEM，199 均可), 吸取其中 100ul，用离心涂片机以 1500rpm离心 6min 制备细胞涂片 6 张以上，过夜后用锡铂纸包存于低温冰箱（-30）,支气管肺泡灌洗液的收集及计数,每组小鼠经气管插管后，用无菌生理盐水灌洗2次，每次0.8ml，收集得到BALF，之后，打开小鼠胸腔，区肺组织保存于液氮之中待用。将收集的回收BALF(80%一90%）于43000r/min离心10min.收集上清液保存于-80 冰箱中；将下层细胞均匀涂布于载玻片，经固定，H-E染色。光学显微镜下进行分类计数，计数200个，计算其中的中性粒细胞，巨噬细胞，淋巴细胞等各占的百分比。,小鼠肺组织病理学检查,准备小鼠肺组织石蜡切片 将小鼠腹腔麻醉后固定实验台上，取出血液标本后，打开胸腔，轻轻剪取右肺其中一小叶肺组织，于生理盐水中快速漂洗表面血迹后，置于4%多聚甲醛中进行固定24小时后取出，用清水快速将残留的甲醛冲洗干净，将标本进行梯度脱水后石蜡包埋，将包埋的肺组织切成月4um的薄片，置于40 的温水中展开，用铺好胶的玻片将其捞起，将粘有蜡片的玻片在43 烤片机上烤2H，待切片完全干透粘劳后，4 保存备用。,H-E染色,1.二甲苯10min x2次 2,.无水酒精5min x2次 3.95%酒精5min 4.自来水洗5min 5.苏木素染液浸 5-10s 6.自来水冲洗直至发蓝为止 7.盐酸酒精(比例为1:99）洗10-20s 8.自来水冲洗10s 9.70%酒精5min 10.80%酒精5min 11.90%伊红乙醇洗5-10min 12.95%酒精5min 13.95%酒精10min 14.无水酒精10min x2次 15二甲苯10min3次 16.采用中性树胶封片 17.在37 烤箱中过夜 18显微镜下观察,小鼠肺组织病理学观察及形态,小鼠肺组织病理学观察及形态,免疫组化实验原理与意义,免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通 过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新 技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧 光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋 白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等),1. PBS缓冲液（ph7.27.4）；NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 20.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。 30.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTAph7.0-7.4适合光学纤维标本,试 剂,气道粘膜石蜡切片的免疫组化,免疫组化染色SP法 1） 脱蜡、水化 2）PBS洗2-3次各5分钟 （3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟 （4）PBS洗2-3次各5分钟 （5）抗原修复 （6）PBS洗2-3次各5分钟 （7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体 （8）滴加抗50l,室温静置1小时或4过夜或371小时 （9）4过夜后需在37复温45分钟 10）PBS洗3次每次2分钟 （11）滴加抗45-50l,室温静置或371小时 （12）抗中可加入0.05%的 tween-20. （13）PBS洗3次各5分钟 （14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度 （15）PBS或自来水冲洗10分钟 （16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化 （17）自来水冲洗10-15分钟 （18）脱水、透明、封片、镜检,免疫组化SABC法,（1） 脱蜡、水化 （2）PBS洗2次各5分钟 （3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次 （4）抗原修复 （5） PBS洗5分钟 （6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体 （7）滴加抗50l,室温静置1小时或4过夜或371小时 （8）PBS洗3次各2分钟 （9）滴加生物素化抗，20-37 20分钟 （10）PBS洗3次各2分钟 （11）滴加试剂SABC 20-30 20分钟 （12） PBS洗4次各5分钟 （13） DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色 （14）脱水、透明、封片、镜检,免疫组化问题解答,1、染色过强 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度 DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准 2.非特异性背景染色 原因 解决方法 a 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟 b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长 c 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭 d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间 3染色弱 原因 解决方法 a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时，间不能少 于60分钟 b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂 c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液 使试剂稀释 （应防止切片干燥） d 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜 e 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟 ,4.染色阴性 原因 解决方法 a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照 b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果 c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误,肺组织蛋白提取,将冻存已称重的肺取出置于冰上，按900ul/mg的比例加入肺组织裂解液，使用肺组织匀浆器匀浆至均匀，然后按250ul/ml的比例加入5xLaemmile Sample Buffer匀浆至果冻样，置于冰上，用超声破碎仪(强度为28%,4s on， 4s off，共8分钟)，然后离心30min（4 ,12000rmp/min）取上清液并。分装与1.5ml离心管中，置于-80 冰箱中保存。,肺组织蛋白浓度测定,1.按试剂盒说明书配置工作液和相容性试剂溶液 2.标准品空白，标准品，样品空白，和未知样品各加入9ul在孔中心（两个重复） 3.每孔加入4ul相容性试剂溶液。 4.摇床1min，37 孵育15分钟。 5.每孔加入260ul工作液，摇床1min，37 孵育30min。 6室温冷却5min 7.使用标准品空白作为空白对照，562nm测吸光度（注意：在室温，吸光度以0.25%/min的速率上升）。 8.所有未知蛋白样品的复孔的562nm吸光度值减去样品对照复孔的吸光度值。 9.用经过空白对校正的BCA蛋白标准品562nm吸光度值与其浓度（ug/ml）来绘制标准曲线，用标准曲线计算蛋白样品的浓度。 10.将所有的蛋白样品按上样量30ug计算体积，用裂解液补齐体积后，加入适量的5xloading buffer 后，将蛋白在沸水中5min，是蛋白变性，置于冰上5min待用。,肺组织蛋白浓度测定,1.制备分离胶和浓缩胶 2.电泳：120V 10min ；150V 50min 3.转膜：300mA ，70min 4.封闭，5%MILK-TBST中进行封闭，常温下2小时，或者4 过夜， 5.一抗孵育，常温2H，TBST洗3次，每次10min 6.二抗孵育，常温1H， TBST洗3次，每次10min 7.成像。 8.扫描wester blot 条带，用Imagej图像分析仪软件分析免疫印迹的灰度值。,分离胶，浓缩胶配置,血浆、BALF 中细胞因子 ELISA 测定,酶联免疫分析技术(ELISA) 酶联免疫分析的基本原理和方法类型 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。 ELISA可用于测定抗体，也可用于检测抗原。常用方法,ELISA 测定三种类型,间接法 此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定,酶联免疫分析技术(ELISA)间接法,操作步骤： 用已知抗原包被固相载体； 加待检标本，经过温育(372h)，使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无关的物质； 加酶标抗抗体再次温育(372h)与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体； 加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测光密度值定量测定。,酶联免疫分析技术(ELISA)间接法,1.包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至110gml，每孔加0.1ml，4过夜。次日洗涤3次。 2.加样：加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照） 3.加酶标抗体：于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37孵育3060分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，371030分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。,双抗体夹心法,双抗体夹心法 此法常用于测定抗原。 将已知抗体吸附于固相载体加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。 见下图：,双抗体夹心法,操作步骤： 用已知特异性抗体包被固相载体； 加待检标本，经过温育使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去无关的物质； 加酶标特异性抗体，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去未结合的酶标抗体； 加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测量光密度值进行定量测定。 此法适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。,双抗体夹心法,用于检测未知抗原的双抗体夹心法： 1. 包被：用0.05M PH9，碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110gml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml，37孵育0.51小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，371030分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。,竟争法,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。见下图：,竟争法操作步骤,1.用已知特异性抗体包被固相载体； 2.测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原，经过温育，使二者与固相抗体竞争结合；对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合。分别洗涤，除去未结合的成分； 3.加底物显色。 对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物显色反应较弱。分别测定两管的光密度(OD)值，根据对照管与测定管OD值之比计算标本中待测抗原含量。,Q-PCR实验流程,Q-PCR用途,Q-PCR实验流程,实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。,总RNA抽提,1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min； 组织样品充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称） 2）加入200l氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致） 3） 4下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层） 4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min； 5）4下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清； 6）用75乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。 7）视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。,RNA提取-RNA质量,去基因组,使用RNase-free的DNase （Promega），按以下体系配置反应液，37消化30min，65灭活10min。,然后按以下步骤操作： 1) 加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。 2) 加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。 加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），-20静置15min； 4下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清； 用75乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），超净台风干； 加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。,四、总RNA纯度和完整性检测,纯度检测： 取1l RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。 总RNA完整性检测： 取RNA样品1l，1琼脂糖凝胶电泳80V20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。,mRNA逆转录,1）在RNase free的PCR管中配置下列溶液. 2）将上述溶液吹打均匀，置85保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷， 以防止RNA复性； 3）在该PCR管中加入下列试剂（Promega） 4）将上述20l反应溶液30保温10min； 5）42保温50min； 6）85保温10min； 7)-20保存。,microRNA逆转录,使用茎环逆转录法，原理如下图：.,在去RNase的PCR管中配置以下溶液： 2）将上述溶液混匀，85孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构； 3)在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液： 4）将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30保温10min； 5）42孵育50min； 6）85孵育10min灭活逆转录酶。,定量PCR检测,1.引物测试：根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。 得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。 2确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。（1）一个样品的加样尽可能安排在同一行（2）如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板 3正式实验：体系配制： H2O 4ul SYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)(使用前需振荡均匀) 上游引物 0.5ul （10uM） 下游引物 0.5ul （10uM） 计算好实验中需用多少份体系总体积15ul，则按具体量配置。体系分装会有损失，一般多配0.5份-1份体系。 总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中 4cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。） 5把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。 上机。,琼脂糖凝胶电泳,1.琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离 2.琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 3.琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。 4.蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在69之间，离子强度0.020.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。 5.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。,琼脂糖凝胶电泳操作流程,准备干净的配胶板和电泳槽 注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 1.选择电泳方法 一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 2正确选择凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.52%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 3.适合的电泳缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象 4.电泳的合适电压和温度 电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 5. DNA样品的纯度和状态 注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。,琼脂糖凝胶电泳操作流程,6.DNA的上样 正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。 7. Marker的选择 DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择DNA/HindIII或者DNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象 8.凝胶的染色和观察 实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。,琼脂糖凝胶的优点.缺点,优点: (1)操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 (2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 (3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。 (4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 缺点： 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少,DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理,DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。 在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。 核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,操作步骤,1. 准备用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子,2. 配制1%琼脂糖凝胶及倒胶,具体步骤： 三角瓶内：0.6g琼脂糖 +60ml(0.5TBE) 煮胶溶解 冷却至60(不烫手) 加EB 倒板 室温下充分凝固 垂直向上拔出梳子 将胶板放入电泳槽 向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面12nm。,3. 加样,将DNA样品（5ul）与6 上样缓冲液（1ul） 混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内。 注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。 每加完一个样品要更换枪头，以防止EB污染。,4. 电泳,接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极之间的距离计算） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳,5. 结果观察,电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带及其位置，记录实验结果。,1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60 ，否则温度太高会使制板变形； 2、 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔； 3 、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不要刺穿凝胶； 4、EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔； 5 、紫外线照射不要太久。,6注意事项,小鼠腹腔巨噬细胞收集及形态观察,1.提前3天小鼠腹腔注射1.5ml3%的巯基乙酸培养基（已经灭毒的溶液） 2.巨噬细胞取出a：腹腔内注射1.5ml3%的巯基乙酸培养基三天后，将小鼠以颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡15min，仰卧，固定四肢 b:在无菌台中打开小鼠腹部皮毛，操作要轻柔不要破坏腹膜，并用75%酒精局部消毒。C：用10ml注射器吸10mlPBS，从小鼠腹部下方进针，注入小鼠腹腔，并迅速拔出注射器，以免液体外流。D：冲洗小鼠腹腔，提起小鼠尾巴，不断旋转小鼠，让液体与小鼠的大网膜充分接触，以提取更多的细胞。e：轻柔的抽取腹腔内的溶液，f：将回收的小鼠细胞收集在15ml的离心管内，置于冰上，做好标记。,巨噬细胞培养,1.将收集的巨噬细胞离心，1000rcf离心10min 2.弃上清，往细胞沉淀中加入1ml的红细胞裂解液，不断吹打使其成悬浮液，冰上静置5min。 3.1000rcf离心10min，弃上清，加入10%DMEM培养基，反复吹打细胞悬浮。 4.使用细胞计数板在显微镜下计数细胞，并计算出总的细胞数。 5.将收集的细胞平均分配在6孔板中培养。 整个过程在无菌条件下操作。,血细胞形态,正常粒细胞系统形态？ 1、原始粒细胞：胞体直径1018m，圆形或类椭圆形。胞核较大，约占细胞的2/3以上，圆或类椭圆形，居中或略偏位，核染色质呈细砂粒状，均匀、平坦如一层薄砂，无浓集。核膜薄较模糊，染成淡红色。核仁25个，较小，清楚。胞质量少，染成淡蓝或深蓝似天蓝色，透明绕于核周，无颗粒。过氧化物酶染色阴性，但后期有时也可呈阳性反应。 2、早幼粒细胞：胞体直径1220m，较原粒细胞大，圆或椭圆形。胞核大，圆或类椭圆形，位于中央或偏位。核染色质呈粗粒状，较原粒粗，开始聚集。核仁可见或消失。胞质量较多，呈淡蓝、蓝或深蓝色，浆内含大小、形态和多少不一的紫红色非特异的天青胺蓝颗粒，分布不均。过氧化物酶染色阳性。 3、中幼粒细胞： （1、）中性中幼粒细胞：胞体直径1018m，圆形。胞核椭圆形或一侧开始扁平，染色质聚集呈索块状，核仁消失。胞质量多，淡红色，内含中等量、大小较一致的特异的中性颗粒，常伴有少数非特异性颗粒。 （2）嗜酸性中幼粒细胞：胞体直径1520m，胞核与中性中幼粒细胞相似。胞质内充满粗大、均匀、排列紧密、橘红色的特异性的嗜酸性颗粒。 （3）嗜碱性中幼粒细胞：胞体直径1015m，胞核椭圆形，轮廓不清楚，核染色质较模糊。胞质内及核上含有数量不多、排列零乱、大小不等的紫黑色特异的嗜碱性颗粒。,4、晚幼粒细胞 （1、）中性晚幼粒细胞：胞体直径1016m，呈圆形。胞核明显凹陷呈肾形、马蹄形、半月形，但其核凹陷程度一般不超过核假设直径的一半。核染色质粗糙，排列更紧密，核仁消失。胞浆量多，染浅红色，充满中性颗粒。 （2、）嗜酸性晚幼粒细胞：胞体直径1016m，胞核在中央或偏一侧，呈肾形或椭圆形。核质充满着嗜酸性颗粒，其颗粒粗大呈橘红色，大小一致，但有时见到深褐色或紫棕色颗粒。 （3、）嗜碱性晚幼粒细胞：胞体直径1014m。胞核固缩呈肾形，轮廓模糊。胞质内及核上含有少量、分布不匀的嗜碱性颗粒。 5、杆状核粒细胞： （1、）中性杆状核粒细胞：胞体直径1015m，圆形。胞核凹陷程度超过核假设直径的一半，核径最窄处大于最宽处1/3以上，形态弯曲成带状，粗细均匀，核染色质粗糙呈块状，也可见核呈“S”形、“U”形或“E”形，核两端钝圆染深紫红色。胞质充满中性颗粒。 （2、）嗜酸性杆状核粒细胞：胞体直径1116m，圆形。胞核与中性杆状粒细胞相似。胞质充满着粗大的橘红色嗜酸性颗粒。 （3、）嗜碱性杆状核粒细胞：胞体直径1012m。胞核呈模糊杆状。胞质内及胞核上含有紫黑色、大小不匀、数量较少的嗜碱性颗粒。 6、分叶核粒细胞： （1、）中性分叶核粒细胞：胞体直径1014m，圆形。胞核分叶状，叶与叶之间有细丝相连或完全断开，或者虽未断开，但有粗而明显的切痕。核常分25叶，核染色质浓集或呈较多小块，染深紫红色。胞质丰富，染淡红色，浆内分布着细小紫红色中性颗粒。 （2、）嗜酸性分叶核粒细胞：胞体直径1116m。胞核多分为两叶。胞质充满着粗大呈橘红色嗜酸性颗粒。 （3、）嗜碱性分叶核粒细胞：胞体直径1012m。胞核可分34叶或分叶不明显，常融合呈堆集状。胞质嗜碱性颗粒呈紫黑色，大小不一，分布不均，常掩盖在核上，以致核的形态看不清，有时很难确定为哪一个阶段细胞。,正常单核细胞系统形态？ 1、原始单核细胞：胞体直径1520m，圆或椭圆形。胞核较大，圆形、类圆形，核染色质纤细，呈疏松网状，结构不清晰，核仁13个。胞质较其它原始细胞丰富，呈灰蓝色，不透明，边缘不规则，有时可见伪足状突出。 2、幼稚单核细胞：胞体直径1525m，圆形，不规则形。胞核圆或不规则形，呈扭曲折叠状，有凹陷或切痕，核染色质较原单核细胞粗糙疏松，呈丝网状，核仁隐匿或无。胞质较多，染灰蓝色，可见细小染紫红色的天青胺蓝颗粒。 3、单核细胞：胞体直径1220m，圆或不规则形，但常可见钝伪足。胞核形态不规则，常呈肾形、马蹄形、“S”形、分叶形、笔架形并有明显的扭曲折叠。核染色质较细致，疏松呈丝网状或条索状。胞质量多，染灰蓝色和淡粉红色，半透明如毛玻璃样。浆内见更多细小的、分散均匀的灰尘样紫红色天青胺蓝颗粒，有时偶见空泡。 4、巨噬细胞：单核细胞进入组织内变成巨噬细胞，定居于组织的特异性巨噬细胞可有不同名称，如肝的枯否细胞等。静止性巨噬细胞原称组织细胞。胞体大小变异甚大，直径2080m，被激活后可达100m以上，外形不规则。胞核圆形、椭圆形、肾形、马蹄形、或不规则形，核染色质呈粗糙海绵状，分布不均匀，可有明显核仁，多为12个。胞质丰富，嗜碱，呈灰蓝色，内含天青胺蓝颗粒，空泡多见，可含有大量吞噬物。、 正常淋巴细胞系统形态？ 1、原始淋巴细胞：胞体直径1018m，圆或椭圆形。胞核核大，位于中央或稍偏一侧，圆或椭圆形，核染色质细致，呈颗粒状，但比原粒细胞稍粗，排列匀称，核膜浓厚，界限清晰，核仁多为12个。染淡蓝色，由于其周围的染色质浓染呈围堤状而常清晰可见。胞质极少，呈淡蓝色，透明，核周界明显，无颗粒。 2、幼稚淋巴细胞：胞体直径1016m。胞核圆或椭圆形，偶有小的凹陷，核仁模糊不清或消失，核染色质仍较较细致，胞质较少，淡蓝色，偶有少许深染紫红色天青胺蓝颗粒。 3、淋巴细胞： （1、）大淋巴细胞：胞体圆形，直径1215m。胞核椭圆形稍偏一侧，核染色质排列紧密而均匀，浓染呈深紫红色。胞质较多，呈清澈的淡蓝色，可有少量大小不等的天青胺蓝颗粒。 （2、）小淋巴细胞：胞体圆形，直径69m，胞核圆形或有小切痕，核染色质聚集紧密成大块状，结块的边缘不清楚，染紫红色。胞质量很少，颇似裸核，如可见，呈淡蓝色，一般无颗粒。,正常浆细胞系统形态？ 1、原始浆细胞：胞体直径1418m，圆或椭圆形。胞核圆形，占细胞的2/3以上，居中或偏位，核染色质呈粗颗粒网状，染紫红色，核仁25个。胞质量多，染深蓝色，不透明，核附近较淡染，无颗粒。 2、幼稚浆细胞：胞体直径1216m，多呈椭圆形。胞核圆或椭圆形，占细胞1/2以上，居中或偏位，核染色质较原始浆细胞粗糙紧密，开始聚集，染深紫红色，核仁基本消失，有时隐约可见。胞质量多，染深蓝色，不透明，通常近核处有淡染色区，有时可有空泡及少数天青胺蓝颗粒。 3、浆细胞：胞体直径815m，圆或椭圆形。胞核明显缩小，较圆可占细胞1/3以下，偏于细胞一侧，核染色质浓密成块，常排列成车轮状，无核仁。胞浆丰富，染蓝色或红蓝相混的蓝紫色，有泡沫感，核的外侧常有明显的淡染区，浆内常有小空泡，偶见少数天青胺蓝颗粒。,血液学检查,(3)成纤维细胞,淋巴细胞,小鼠呼吸道上皮细胞的提取与培养,按照右图配置完全培养基，过滤，50ml/支分装，4度保存，有效期为一周。主要材胎料和试剂：小鼠，DMEM/F12F粉末，胎牛血清，牛血清白蛋白，牛垂体提取物，胰岛素，转铁蛋白，表皮生长因子，氢化可的松，链霉蛋白酶，维甲酸，红细胞裂解液，I型胶原，无组织包被的24孔板,培养皿胶原包被,使用前24h,按3.0mg/mlI型胶原;5XDWEM/F12;0.5mol/L NaOH=4;1;0.15比例配置胶原混合溶液，（胶原偏酸，加入一定比列的NaOH，调节PH值在7.2左右）培养皿冰上垂直放置30min，每孔滴加250ul胶原混合液，37度孵育10min使其凝固，后继续追加150ul胶原溶液， 37度孵育至少1h，使其底胶原表面平整，最后在加入0.5ml完全培养基，制作完成，4度保存备用。 小鼠气道的分离 健康雌雄小鼠，7-8周龄，18-20g/只，小鼠经颈椎脱臼处死，将其固定于手术台上，翘起头部，在其胸腹部有酒精消毒，注意保护口腔和鼻道，免受酒精刺激，无菌条件下沿着腹白线剪开皮肤，暴露腹主动脉，切开放血值流尽，其目的在于避免分离呼吸道上皮细胞时混入过多红细胞，钝性分离肌肉，暴露气管，并将其游离，穿双股5号手术线，在气管上下端各打一松结，在该上端的结上缘切开小口，又注射器吸取适量的PBS将气管内外的血液冲洗干净，让后用装有TIP头的空心导管，深入为5mm左右，西紧原先的结，使得导管固定于气管内部，在下端的结和气管分叉处剪断，取尽可能长的气管段，去除多余的组织。 气道组织的消化和红细胞的去除 像导管内注入4度预冷的0.05%的链霉蛋白酶，灌洗气道内壁至洁净，当酶液滴了两三滴后结扎游离端，在注入酶液使气道充满。吧气体排尽。再将整段气道浸润在DMEM/F12中，4度孵育过夜，第二天，收集消化液，并用5ml注射器吸取DMEM/F12冲洗气道，收集冲洗液约为5ml，将消化液和冲洗液合并后转移至15ml离心管，并加入红细胞裂解液1000rpm/min离心7min，去除上清液，然后用适量的DMEM/F12充分重悬细胞。,成纤维细胞的去 将重悬细胞接种于加有完全培养基的无组织包被的培养皿中，约1h后，成纤维细胞由于附着能力好，较呼吸道上皮提前贴壁而被去除，该原理类似差速贴壁法，采用无组织包被的培养皿，更有利于细胞的分离纯化。 呼吸道上皮细胞的原代培养 当绝大数的成纤维细胞已近贴壁后，取出上清液转移至新的完全培养基的胶原包被培养皿中继续培养，此时应观察旧的培养皿中的呼吸道上皮细胞是否被彻底转移，若没有，可以用完全培养基反复冲洗，进行细胞计数，而后，按每孔5X104个细胞的密度街道24孔板中，每天行换液处理，约7d左右细胞将达到较高的融合度，本法所获细胞可继续传代培养3-4代，但是状态渐差，建议用原代细胞实验。,胞培养基本技术胞培养基本技术,无菌操作技术 体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。 【操作野消毒】 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 【火焰消毒】 在无