研究生分子医学实验技能实验三.ppt

生化与分子生物学技术,中山医学院 生物化学与分子生物学教研室,实验五：大肠杆菌感受态的制备 实验六：重组DNA的转化与抗药性筛选,实验五,大肠杆菌感受态的制备,一、 基 因 克 隆(GENE CLONE),1、 概述 也称为基因工程，即将外源基因和载体系统所组成的重组体在一定的受体细胞或宿主细胞内复制和表达的过程。,2、基 本 步 骤,（1）分（分离目的基因）：从生物体复杂的基因组中分离出所需要的DNA片段，即目的基因 （2）切（切割目的基因和基因载体）：用限制性内切核酸酶切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体。 （3）接（连接目的基因和基因载体）：在体外将目的基因连接到能够自我复制的载体DNA分子上，形成重组DNA（重组体）。,（4）转（转化至宿主细胞）：将重组体引入（转化或转染）到宿主细胞（受体细胞）中，转化后的细胞进行扩增繁殖，获得大量的细胞繁殖群体。 （5）筛（筛选阳性细胞克隆）：从大量的细胞繁殖群体中筛选出转化成功（带有重组体）的阳性细胞克隆。 （6）表（表达目的蛋白质）：重组体在宿主细胞中表达目的蛋白质。,基因工程,二、感受态细胞的制备及重组体转化,重组体转入受体菌,转化（transformation） 转染（transfection） 感染（infection）,转化方法,CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG介导转化 人工体外包装,特殊处理,受体细胞,细胞膜特性改变,感受态(competent)：宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞. 正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞通透性增大，处于感受态。,制备感受态细胞和转化的常用方法 CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到51062107转化子/g质粒DNA,简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。 电穿孔转化法、脂质体(liposome)法、胞核的显微注射法(microinjection)； 磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；,CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理 一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。当细菌处于冰冷（0）0.050.1M的 CaCl2低渗溶液中，菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取能力增强，转化效率提高（感受态细菌）。 同时在转化体系中的DNA形成的抗DNase的羟基钙磷酸复合物能粘附于细菌表面，经过42短时间热休克（heat shock）处理，促进感受态细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培养(selective culture)平板上即可筛选出所需的转化子。,0.1mol/LCaCl2,0,重组体,感受态细胞,转化与感受态细胞 转化(transform)：在分子克隆技术中，转化特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 区别转化、转染(transfection)与转导(transduction),重组DNA分子导入受体细胞的手段 将含有真核生物基因的质粒导入细菌内进行表达称为转化。 转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。 转导则是指病毒从被感染的细胞(供体)释放出来，再次感染另一细胞(受体时)，发生供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。,三、感受态细胞制备及重组体转化的实验操作及注意事项,细菌转移到一冰冷的1.5ml的EP管，40C，4000rpm5min,弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 300l，重悬菌体，冰浴20min,40C，4000rpm5min 弃上清，将管倒置于滤纸上1min，使液体流干净 沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 110 l，重悬菌体。,每管加入质粒5l,轻轻旋转EP管，混匀混合物，在冰浴上放置20min,试管放入420C的水浴中，放置90s，不要摇动EP管,迅速将EP管转移到冰浴，冷却12min,取出EP管后，每管加入LB培养基800l， 置于370C摇床（100150r/min），温和震荡45min 用无菌弯头玻璃铺菌器将200l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面 室温放置10min，使液体被吸收 倒置平皿，370C培养，12小时可见菌落生长,重组DNA的转化与抗药性筛选,实验六,重组体克隆的筛选与鉴定,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA的阳性克隆。,筛选的依据： 基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。 筛选的方法： 抗药性标志的选择 插入表达筛选 -半乳糖苷酶系统筛选（-互补） (-半乳糖苷酶能将X-gal转变为不溶性的深蓝沉淀）,(插入失活法) 抗药性标记选择,目 录,菌落杂交筛选法 内切酶图谱鉴定 PCR筛选重组子 Southern印迹杂交和菌落原位杂交 DNA序列分析 免疫化学检测法,原理：基因载体上含有-半乳糖苷酶（LacZ)的基因，当外源DNA插入到载体的LacZ基因上后将造成-半乳糖苷酶失活，就不能分解培养基中的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）产生蓝色产物，结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含