课件：实验二细菌的革兰氏染色及芽孢染色法.ppt

实验二 细菌的革兰氏染色及芽孢染色法,实验一存在问题,1、香柏油要加适量 2、涂完菌后接种环一定要灼烧灭菌 3、无菌操作 4、擦镜纸浪费 5、载玻片要洗干净 6、画图不符合要求,细菌 个体微小 半透明,未 染色 细菌大致形态大小,单染色法,复染色法,能看清形态大小 但是无鉴别意义,能看清形态大小 又有鉴别意义,显微镜,细菌的染色,（一）实验目的：,1、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。 2、巩固显微镜油镜的使用技术和无菌操作技术。,革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。,（二）实验原理革兰氏染色原理,革兰阳性菌细胞壁的化学组成,肽聚糖（15-50层）,细胞膜（双层脂质 蛋白嵌镶）,脂质,蛋白质,-1,4糖苷键,N-乙酰葡萄糖胺,N-乙酰胞壁酸,四肽链,五肽桥,革兰阴性菌细胞壁的化学组成,外膜,肽聚糖（1-3层）,细胞膜,脂质,蛋白质,脂质双层,脂蛋白,脂多糖,G+菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，网格结构紧密，含脂量低，当被酒精脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了不溶性结晶紫-碘复合物的逸出，还是原来的颜色。 G肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。,结晶紫初染,碘液媒染,乙醇脱色,番红复染,涂片固定,（二）实验原理革兰氏染色原理,芽孢（内生孢子）及其研究芽孢的重要性 芽孢是某些G+菌形成的圆形或椭圆形的休眠体，抗热性和折光性较强。 芽孢的大小、形态、位置可做分类依据。,（二）实验原理芽孢染色法原理,中央芽孢,偏端芽孢,游离芽孢,末端芽孢,（二）实验原理芽孢染色法原理,芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难； 但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，染料可进入菌体和芽孢； 进入菌体的染料经水洗后可被脱色； 当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染剂颜色（红色）。,1、活材料： 革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）和培养24h大肠杆菌（Escherichia coli） 芽孢染色：培养28-36 小时 的蜡状芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis） 2、染色液和试剂： 革兰氏染色染色液：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红； 芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液 ； 二甲苯、香柏油 。 3、器材： 载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。,（三）实验器材,1.细菌涂片标本的制作 （1）涂片 载玻片1张，加1滴生理盐水，取菌研磨均匀。 （2）干燥 室温干燥，或置酒精灯高处慢慢烘烤。 （3）固定 干燥后的涂片，在酒精灯火焰中通过3次。,（四）实验步骤革兰氏染色,2.革兰法染色 （1）初染 结 晶 紫 2min 细水冲洗 甩去积水 （2）媒染 卢戈碘液 1min 细水冲洗 甩去积水 （3）脱色 95%乙醇 20-30s 细水冲洗 甩去积水 （4）复染 番红 3min 细水冲洗 甩去积水,（四）实验步骤革兰氏染色,3.观察实验结果 待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微镜下检查。 革兰阳性菌（G+）， 被染成蓝紫色。 革兰阴性菌（G-）， 被染成红色。,（四）实验步骤革兰氏染色,实验程序（革兰氏染色的方法和步骤）,涂片,蒸馏水,涂片,结晶紫,碘 液,95%乙醇,自然干燥,媒染1min,脱色2030s,初染1min、后水洗,固定,番红,复染2min,干燥 镜检,水洗时不要直接冲菌膜,水洗,水洗,水洗,每人取大肠杆菌和枯草杆菌，做一块混合涂片，进行革兰氏染色。,2分钟,1分钟,3分钟,干燥固定,取一干净载玻片在两端各加一滴生理盐水无菌操作取菌种涂于生理盐水中（成菌膜） 自然干燥火焰固定初染（结晶紫，2min） 水洗媒染（碘液，1min） 水洗脱色（乙醇，20-30s） 水洗复染（蕃红，3min） 水洗自然干燥观察。,（四）实验步骤革兰氏染色,涂片时，滴生理盐水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄； 酒精脱色：是革兰氏染色成败的关键，要求脱至流出的乙醇不带颜色为止，立即水洗。若脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后（冲反面），应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。,革兰氏染色注意事项,制备菌悬液 染色 涂片固定 脱色 复染 镜检,改良的Schaeffer-Fulton氏染色法,（四）实验步骤芽孢染色,芽孢染色-制备菌悬液,生理盐水,1、滴生理盐水,挑取2-3环菌苔,与生理盐水混匀,2、制备菌悬液,在EP管中滴2 滴生理盐水,芽孢染色-染色,5%孔雀绿染液,1、滴加孔雀绿染液,沸水浴加热 15-20min,2、加热染色,在离心管中滴2-3 滴孔雀绿染液,芽孢染色-涂片固定,经孔雀绿染 色细菌悬液,1、滴菌悬液,用接种环 均匀涂布,2、涂片,接种环取菌悬液 在载玻片中央,3、干燥,室温自然晾干,4、固定,通过酒精灯 火焰3次固定,芽孢染色-复 染,0.5%番红水溶液,1、滴番红水溶液,滴加数滴番红染液在菌膜上，染色2min,2、水洗,不要直接冲菌膜,蜡状芽孢杆菌（B.cer） 1、制备菌液：加2滴蒸馏水于1.5ml离心管中，用接种环从斜面挑取菌体2-3环于离心管中充分混匀。（2人一组） 2、染色：加孔雀绿2-3滴于小试管中。 3、加热：沸水浴，15-20分钟。 4、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制成涂片。 5、干燥、火焰固定 6、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。 7、复染：加番红水溶液染色2-3分钟，水洗，吸水纸吸干。 、镜检：10x ，40x 、100X（油镜）观察。绘图,（四）实验步骤芽孢染色,1.分别绘出枯草杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的结果。用红蓝笔画出模式图。 2.绘出芽孢的形状和着生位置，并注明染色结果（菌体颜色和芽孢颜色）。,（五）实验作业,思考题： 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。,本次实验课结束 请确保油镜头擦拭干净！,擦油镜镜头方法： A）先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油 B）用擦镜纸沾少许二甲苯，擦拭镜头； C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it in