唾液DNA提纯试剂盒说明书(最终版).doc

Just-a-Tube 唾液DNA提纯试剂盒说明书室温保存，RNase A 保存在4 C。试剂盒组成及贮存Just-a-Tube 唾液DNA提纯试剂盒可从Charm-Protect唾液收集和储存液中提纯gDNA，其组成如下表所示。所有的组分除了RNase A 需要保存在4 C之外，其余组分室温保存即可。可进行50, 250 或者5次gDNA的提纯。产品目录号Product Catalogue #QT-275-MQT-275-LQT-275-S纯化规模Purification Scale502505结合管（BT3） Binding Tube (BT3)502505结合缓冲液（KB6）Binding Buffer (KB6)10.0 ml50.0 ml1.0 ml洗涤液-1（WB1）Washing Buffer I (WB1)5.5 ml27.5 ml0.55 ml洗涤液-2（WB2） Washing Buffer II (WB2)18.0 ml90.0 ml1.8 ml洗脱缓冲液（EB2）Elution Buffer (EB2)5.5 ml27.5 ml0.55 mlRNA切酶A（RA2）RNase A (RA2) (20 mg/ml)1.1 ml1.1 ml 50.11 ml产品介绍利用Just-a-Tube 唾液DNA提纯试剂盒可以简单，迅速地从Charm-Protect唾液收集和储存瓶的唾液储存液中分离到高质量的DNA。DNA样品的纯化仅在一个小管中进行。在这个过程中不需要膜或磁珠结合来DNA。昌美生物科技有限公司将固体表面可逆结合技术（SSRB）应用到Just-a-Tube系统中，离心管底侧涂有可与唾液裂解液中DNA选择性高效结合的结合剂。在结合缓冲液作用下，结合剂可特异性结合gDNA，而蛋白和其它的成分保留在溶液中。未结合的物质经涮洗后予以去除。纯化的gDNA经10 mM Tris 洗脱液或去离子水洗脱。纯化的gDNA可直接用于下游反应，如限制性酶切反应，SNP分析，PCR，序列分析，全基因组扩增（WGA）和DNA甲基化分析等。所需的额外材料*96-100 %乙醇，*异丙醇，*1.5 ml 或2.0 ml离心管，*武汉昌美生物技术有限公司生产的唾液收集和保存瓶中的Charm-Protect唾液DNA保存液，*移液器和吸头，*可离1.5ml或2ml离心管的离心机,*涡旋振荡器,*水浴锅或恒温金属浴,常规防范1该试剂盒仅用于实验。2实验操作时穿实验服，戴一次性手套和眼镜。避免摄取和吸入试剂，避免与试剂盒中试剂进行皮肤接触，一旦接触，用手彻底冲洗。3提纯核酸DNA时，避免核酸酶的污染，使用无菌新吸头避免交叉污染。实验之前的准备工作1. 从唾液裂解液中提纯gDNA之前，需要根据提纯的样品数目制备新鲜的工作结合缓冲液。工作结合缓冲液由结合缓冲液（KB6）与100%异丙醇以1:4体积均匀混合得到，如配制500 l 工作结合缓冲液：将100 l 结合缓冲液（KB6） 与 400 l异丙醇混合均匀。制备的工作结合缓冲液的体积根据： (1)待提纯的样品数目；(2) 预期的损失， 在悬浮过程中，一般会损失10% 。制备的工作结合缓冲液（KB6）, 每100 l 细胞裂解液加100 l含异丙醇的工作结合缓冲液（1:1比例）。剩余的结合缓冲液当天予以丢弃。2. QT-275-M 试剂盒, 加22 ml 100 %乙醇到Washing Buffer I （WB1）中，充分混匀。 QT-275-L 试剂盒, 加110 ml 100 %乙醇到Washing Buffer I （WB1）,充分混匀。QT-275-S 试剂盒, 加2.2 ml 100 %乙醇到Washing Buffer I （WB1）,充分混匀。（在瓶上做好标记表示已加乙醇！）。室温保存，加乙醇的WB1在六个月之内使用。3. QT-275-M试剂盒，加72 ml 100 % 乙醇到Washing Buffer II（WB2）中，充分混匀。 QT-875-L试剂盒，加360 ml 100 % 乙醇到Washing Buffer II （WB2），充分混匀。QT-875-S试剂盒，加7.2 ml 100 % 乙醇到Washing Buffer II （WB2），充分混匀。（在瓶上做好标记表示已加乙醇！）。室温保存，加乙醇的WB2在六个月之内使用。4. 该试剂盒可从100 l直到1000 l唾液保存液中提纯gDNA。如果有需要，4 ml 唾液保存液也可以在一次提纯过程中被提取。在进行gDNA提纯实验之前，为了避免gDNA降解，请遵守标准的Charm-Protect唾液DNA保存液收集和储存程序.操作程序制备裂解液下列程序是从1 ml唾液保存液中提纯gDNA。可根据唾液保存液实际体积作相应调整。1 取20 l RNase A（RA2）到1.5 ml 或2.0 ml 离心管中。2 将储存在Charm-Protect唾液收集瓶中的唾液样品与唾液保存液颠倒和震荡7-8次。静置3-5分钟。3 从唾液收集瓶中吸取1 ml 唾液保存混合物到预先加了RNase A的离心管中，吸头吹打8-9次，或将离心管盖子盖上后颠倒离心管7-8次，混合均匀。（当吸取唾液混合液时，注意不要吸到收集瓶底颗粒状沉淀。）4 将离心管置于65 C水浴锅或金属浴中温育10分钟。期间颠倒混合离心管，也可将样品50 C温育过夜。5 将离心管以最大转速（13000 rpm或16000 g）离心2分钟来去除颗粒物质，如食物颗粒，未经消化的死细胞和纤维碎片。结合程序1转移900 ul 澄清的唾液裂解液到一个结合管（BT3）中，注意不要吸到离心管底的碎片沉淀。注意：为避免吸到管底的碎片沉淀，吸的时候可以留150-250 l溶液在离心管中。2. 加900 l 含有异丙醇的工作结合缓冲液（KB6）到结合管（BT3）中，充分混匀。（注意：将工作结合缓冲液与唾液裂解液彻底混匀这一步非常重要）3. 将结合管（BT3）在室温下以最大转速（13000 rpm或16000 g）离心3分钟来结合DNA。（注意：在离心过程中，离心管盖朝向转子方向放置，离心后DNA大部分聚集在背对管盖的管底一侧。)4打开盖子，用吸头吸走结合管底中央的液体，注意在吸的过程中，吸头不要碰到管壁，因为DNA吸附在管壁上。5、 可选择操作。如果处理超过1 ml 的唾液保存混合液，重复步骤1-3直到所有的唾液混合物都被利用。（注意：加了澄清的唾液裂解液到结合管之后，再次加唾液裂解液时，需将唾液裂解液用吸头吹打5-7次，在加入工作的结合缓冲液（KB6）之前至少温育2分钟。）清洗程序1. 向每管中加500 ml 含乙醇的Washing Buffer I （WB1）。震荡管子4-5次混匀。 室温温育1分钟.2. 在室温以最大转速（13000 rpm或16000 g）离心结合管1分钟。在离心过程中，离心管盖朝向转子方向放置)。3. 用吸头吸走结合管（BT3）管底中央的Washing Buffer （WB1），注意在吸的过程中，吸头不要碰到管壁，因为DNA吸附在管壁上。4. 加800 l 含乙醇的Washing Buffer II（WB2）到结合管（BT3）中。震荡管子4-5次或盖上盖子后颠倒离心管7-8次混匀。5. 在室温以最大转速（13000 rpm或16000 g）离心结合管1分钟。在离心过程中，离心管盖朝向转子方向放置。6. 用吸头去除结合管（BT3）中Washing Buffer（WB2）。 7. 重复步骤4-6，即用Washing Buffer（WB2）洗两次。8. 洗完最后一遍之后，为彻底清除Washing Buffer, 在移除大部分液体后，可以再次短暂离心结合管（BT3），用200 ml 吸头吸走管底中间最后一滴液体，将结合管（BT3）在实验室通风橱晾8-10分钟来去除残余的液体。也可以将管子置于62 C水浴锅或金属浴中晾干3-5分钟。gDNA的洗脱吸附在结合管壁的gDNA至少可以保存六个月。如果gDNA需要洗脱，可进行下面的程序。1. 加20 mL-100 mL 洗脱缓冲液（EB2）到每个结合管管壁（如果需要高浓度的DNA，加20 mL洗脱缓冲液（EB2），选择1或2来洗脱gDNA。）2. 选择1（涡旋洗脱）: 盖上离心管的盖子，涡旋离心管30 秒，以最大转速短暂离心将所有的液体收集到离心管底部。选择2（震荡洗脱）：盖上离心管的盖子，震荡离心管2分钟。选择3（移液枪洗脱）：上下吹打溶液8-10次，盖上离心管的盖子，将管子在室温放置2分钟。3. 洗脱的gDNA可直接应用于下游反应。 或在4 C 短期储存或者20 C 长期储存。 电泳及下游的应用提纯的gDNA可用琼脂糖凝胶电泳进行质检，也可用分光光度计或荧光标记法测量产量。结合管中纯化的gDNA可直接用于下游反应，如限制性酶切反应，SNP分析，PCR，STR分析，DNA序列分析，全基因组扩增（WGA）及其它分子实验操作。常见问题及解决方案问题原因解决方案DNA产量低 起始材料质量差裂解不彻底确保正确遵守手册推荐的样品收集和保存程序。如果是裂解不彻底，65 C 温育时间延长15-30分钟。没有PCR 产物PCR反应液中漏加组分确保加了所有的组分。 Check PCR反应的阳性对照和阴性对照。2013 武汉昌美生物（Wuhan Charm Biot