植物生物技术复习提纲1-3.doc

植物生物技术复习提纲第一章 绪论1、现代生物技术的产生及其主要领域1.1 现代生物技术的产生1）传统生物技术阶段2） 近代生物技术阶段3）现代生物技术阶段1953，DNA双螺旋发现；19611966，遗传密码破译；1972 1974 ，重组DNA技术建立。一般认为，1972 年DNA重组技术的建立，标志着现代生物技术的诞生。现代生物技术（Modern Biotechnology）：即生物技术（Biotechnology），又称生物工程（bioengineering），是指以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他学科的科学原理，设计、改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需要的产品或达到某种目的的一系列技术。1.2 现代生物技术的主要技术领域通常包括：1）基因工程2）细胞工程3）酶工程4）发酵工5）蛋白质工程以基因工程为核心，带动其他“工程”发展。根据应用领域或技术目的不同，现代生物技术又可分为：1）农业生物技术: 动物、植物、微生物；2）医药生物技术；3）工业生物技术；4）环境生物技术；5）海洋生物技术等。1.3 现代生物技术的发展1）各国概况：略。2）现代生物技术发展的三次浪潮：了解。3）生物技术发展的重点领域：未来几年，我国重点领域： 医药、农业、环境生物技术； 基础生物学； 生物多样性和生物安全。2、植物生物技术的发展与应用植物生物技术（plant biotechnology）：是指对植物的性状（产量、品质、抗性等）进行设计和遗传改造，或利用植物生产次生代谢物质和药物等产品的技术。 包括：植物组织和细胞培养；植物基因工程；分子标记及辅助育种。 2.1、植物生物技术的发展简史1）植物组培的奠基和发展 1902，德国 Haberlandt，预言植物细胞全能性。1958，Reinert和Steward ，胡萝卜根韧皮部愈伤诱导出体胚，再生植株，证实细胞的全能性。20世纪6080年代，脱毒快繁、花药/花粉培养、次生代谢物生产、体细胞诱变与筛选、原生质体培养与融合、种植资源保存等研究热。我国组培世界领先。2）植物基因工程的发展1972：体外重组DNA分子成功。1983，首例转基因植物问世。1996，转基因作物投入商品化生产，此后稳定发展。至2006，200多种植物获得转基因植株，有些投入商品化生产。3）分子标记的发展第一代：1980s，基于核酸分子杂交，如RFLP。第二代，1990s，基于PCR或限制酶切+PCR，如RAPD、AFLP、SSR、ISSR、 SCAR、STS等。第三代，近年来，基于DNA测序，如SNP和EST等。2. 2 植物生物技术的应用1）作物育种。2）脱毒与快繁。3）有用物质的生产。4）种质资源保存与交换。5）理论研究。3. 转基因作物（GMC）的发展概况3.1 转基因改良的性状第一代：抗病、抗虫、抗除草剂。第二代：改良品质、增加营养、并有医疗保健功能；抗逆和雄性不育作物。3.2 商业化种植的转基因作物主要是大豆、玉米、棉花；还有油菜、水稻、苜蓿、番茄、马铃薯、西葫芦、杨树、烟草、辣椒、白菜、香蕉、木瓜、亚麻和康乃馨等。3.3 转基因作物的覆盖率：略。3.4 商业化种植的国家2009年25个，前六位是：美国、巴西、阿根廷、加拿大、印度和中国。发展中国家增长快于发达国家。3.5 国内现状转基因植物研究始于1980s初。1993，第一例转基因植物烟草进入大田试验；2002以来，批准商品化种植的有抗虫棉花、耐储/抗病毒番茄、抗病毒甜椒、改变花色的矮牵牛、抗虫杨树和抗病毒番木瓜。从跟踪仿制到自主创新、从实验室探索到产业化的转变。4. 植物生物技术的问题与展望4.1 问题1）安全性问题：生物安全性：转基因发生漂移，产生 “超级杂草” 、破坏当地野生种遗传结构、次生害虫频发、农药用量加大、环境污染等。食品安全性：Bt毒蛋白、过敏原、抗生素抗性标记基因等。4.2 展望农业是生物技术应用最广、最有前景的领域之一。生物技术可拓展和创新农业功能，为农业发展提供持久而强劲的动力，但它不可能完全替代传统农业技术，后者在农业生产中仍将发挥主导作用。思考题：1、 生物技术的概念、主要技术领域（内容）及其发展概况。2、 植物生物技术的内容、应用与发展趋势。第二章 植物组织培养的基本理论、条件与操作技术第一节 植物组织培养的基本理论一、植物细胞的全能性及其表达1. 植物组织培养（Plant tissue culture）： 在离体条件下，利用人工培养基对植物器官、组织、细胞和原生质体等进行培养，使其生长成完整植株的过程。2. 植物细胞的全能性（totipotency）：一个具有完整细胞核的植物细胞，都拥有该植物的全部遗传信息，在适宜条件下能进行表达，具有分化发育成完整植株的潜在能力，称为。植物组培诞生的理论基础。3. 植物细胞全能性的表达全能性的表达：从离体培养的植物细胞或组织诱导分化成完整植株的过程称为。细胞全能性表达须满足2个条件：1）脱离整株；2）营养和激素。二、植物细胞的脱分化与再分化1. 脱分化（dedifferentiation）: 在组培过程中，已分化的成熟细胞失去原来的结构和功能，恢复为分生状态，经分裂形成愈伤，或只形成未分化细胞特性的过程为。分化的逆转。影响脱分化的因素：1）脱离母体。2）生长调节剂。3）外植体生理状态。4）基因型2. 再分化/再生 (redifferentiation/regeneration): 由脱分化的愈伤组织或细胞在一定培养条件下重新分化，形成各种组织、器官甚至完整植株的过程。植物离体再生的途径： 1）器官形成 (organogenesis)：从愈伤组织或外植体形成不定芽、不定根，然后形成完整植株。2）体细胞胚胎发生 (somatic embryogenesis)：从体细胞诱导的愈伤组织形成类似于合子胚的结构（体细胞胚），进一步发育成完整植株。也可直接由外植体再生体细胞胚。三、培养过程中细胞全能性的变化1. 愈伤组织的驯化：原先依赖于某种生长调节剂而生长的培养物，转变为对该物质自养型的现象。特点：无形态发生/再生能力。2. 长期培养物形态发生潜力下降。第二节 植物组织培养的基本条件一、实验室及其设备1.准备室2. 接种室（无菌操作室）3. 培养室4. 细胞学实验室二、培养条件1. 温度：一般25 2。2. 光照：每日光照1216 h，光强10005000 lx。3. 湿度：室内相对湿度70%80%。4. 氧气。 第三节 培养基及其配制一、培养基的成分 培养基=水+无机有机激素固化剂其它1. 水：蒸馏水、自来水（大规模生产）。2. 无机盐 1）大量元素：浓度大于0.5mM或100mg/L。包括N、P、K、Ca、Mg、 S。2）微量元素：浓度低于0.5 mM或100 mg/L, 一般10-710-5M。包括Cu、Fe、B、MnSO4、Mo、Co、Zn。3. 有机化合物1）糖：常用蔗糖。2）维生素常用：VBl (盐酸硫胺素)；VB6 (盐酸吡哆醇)；VB3 (烟酸) ；Vc。3）肌醇。4）氨基酸及有机添加物。一般不用。5）天然复合物：椰乳、酵母提取物等，成分复杂，一般不用。4. 植物生长调节物（plant growth regulator）1）生长素类 (auxin) 2,4-D 常用于愈伤的诱导，NAA常用于生根。2）细胞分裂素类 ( cytokinin )6-BA 和 KT 常用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖。 激素作用的模式：生长素/细胞分裂素的比值决定再分化的方向，该值低可促进芽的分化，而该值高有利于根的分化和形成愈伤，该值适中则利于完整植株的形成。5. 固化剂：常用琼脂。二、培养基的pH值范围 5.56.0，一般 5.8。三、培养基的渗透压培养基中的盐类、蔗糖等影响渗透压。四、常用培养基的种类和特点1. MS：无机盐/离子浓度较高，且较平衡，广泛应用。2. B5：含较低的铵（常抑制生长），适合于双子叶特别是木本植物。3. White：无机盐含量较低，适于生根培养。4. N6 ：成分较简单，KNO3 和(NH4)2 SO4 含量高，用于花药培养。5. KM-8P：有机成分复杂，包括多种单糖和维生素，用于原生质体培养。五、培养基的配制1. 母液的配制为简便和精确而配，4 1个月，沉淀或长菌则丢弃。大量元素：1020倍微量元素：50001000倍铁盐：100倍有机物：100200倍生长调节物质：110 mg/L。配制方法：略。2. 培养基的配制（略）灭菌：高压蒸汽灭菌（1.01.1kg/cm2，121，20min），24 h 内完成。第四节 无菌操作技术一、灭菌方法1. 物理灭菌1.1 高压高温蒸气灭菌（培养基、器皿、用具）：常用。在1 atm/cm2 (0.1Mpa)的压力下，锅内温度达121，持续约20min，可杀死各种微生物的营养体及其孢子。1.2 灼烧灭菌（金属器械 ）1.3 过滤除菌（不耐热物品）1.4 干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）：不推荐。1.5 紫外线照射灭菌（接种室、超净台用）2. 化学灭菌2.1 消毒剂灭菌：常用氯化汞、次氯酸钠、次氯酸钙、70% 酒精。2.2 熏蒸灭菌。二、无菌操作技术在经严格灭菌的超净台或接种室内，使用灭菌的器皿和用品进行操作，叫无菌操作。是组培的关键技术。三、外植体的灭菌与接种外植体（explant）：从活体植物上切取下来，接种在培养基上进行离体培养的无菌组织或器官。1. 外植体的选择：重要，考虑多种因素，见教材。2. 外植体灭菌无菌苗可直接切取外植体和接种。带菌材料需消毒灭菌，才能切取外植体进行接种。常用灭菌剂的使用浓度及时间（表略，见教材）灭菌步骤：取材切割自来水冲洗（几分钟至数小时）70%酒精2060 sec（浸湿表面 ）无菌水冲洗灭菌剂处理无菌水冲洗切取外植体接种。 3. 接种将灭过菌的材料剪切适当大小：叶片0.5cm2，茎段0.5cm长，茎尖0.20.3mm大小，接种于培养基，封口，标名称、日期等，在适宜条件下培养。四、培养过程中的污染及对策 1. 细菌性污染症状：接种后12 d，外植体附近粘液状、泡沫状、混浊、云雾状痕迹。污染原主要来自外植体。对策：严格操作，对外植体彻底灭菌。2. 真菌性污染症状：接种后38 d，外植体附近或培养基上长霉斑。污染原主要来自空气。对策：清洁环境，清洗或更换超净台过滤装置，严格操作。课后复习与作业：1. 名词解释： 外植体 植物细胞的全能性 脱分化 再分化 愈伤组织 2. 如何理解植物细胞的全能性？3. 常用培养基的种类及特点？4. 常用的灭菌方法及用途？5. 用高压高温法进行培养基灭菌应注意什么？ 6. 谈谈你对无菌操作重要性的认识。第三章 愈伤组织的诱导与培养第一节 愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织的诱导与分化培养是植物组培的基本环节。愈伤组织（callus）: 指在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。 一、愈伤组织的诱导及其形态特征1. 愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期：外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。2）分裂期：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞特征，细胞数速增。3）形成期：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。一般，淡黄或淡绿/绿色松脆或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实的愈伤再生能力差。3. 影响愈伤诱导的关键因素关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为。方法：一般每34周继代1次；每次取生长迅速、浅色、疏松的愈伤进行；继代用培养基与原来相同，或根据培养目标、培养阶段不同而改变成分，通常是改变激素配比。继代培养的目的：获得大量优良愈伤，供进一步研究之用。优良愈伤的特点：1）疏松易碎和旺盛的增殖能力，以便建立悬浮系或无性系；2）经长期继代仍保持较强的再分化能力，便于获得再生植株或进行遗传操作。三、悬浮培养悬浮培养（suspension culture）：将疏松易碎、生长旺盛的愈伤小块放入液体培养基中进行振荡培养，以形成分散性好的游离单细胞和小细胞团的培养技术。1. 悬浮培养的用途1）提供一个相对一致的细胞群体，供生理生化、胚胎发生、基因表达等研究。2）次生代谢物质生产。3）细胞突变体的诱变与筛选。4）分离原生质体。2. 影响悬浮培养的因素1）培养基成分；2）细胞密度；3）振荡速度；4）继代时间。3. 悬浮培养物的继代与测定1）继代培养：方法略，见教材。2）细胞增殖的测定：A. 细胞鲜、干重。B. 细胞密实/叠积体积：每毫升培养液中细胞的毫升数。C. 细胞数。第二节 愈伤组织的分化培养与植株再生愈伤组织的分化与植株再生通过器官发生和体胚发生两种途径。一、器官发生与植株再生器官发生（organogenesis）：指培养物在适宜条件下产生不定芽和不定根，然后形成完整植株的过程。又称器官建成/形成/不定器官形成。1. 器官发生的方式/途径1）直接发生：从外植体中已存在的器官原基直接形成相应的器官，或者从外植体脱分化形成的分生细胞团上直接形成器官原基。2）间接发生：由外植体先形成愈伤组织，再由愈伤分化成器官原基并发育成器官。常见方式。2. 器官发生的顺序1）先芽后根：常见。2）先根后芽：较难诱导生芽。3）在愈伤不同部位分别形成根或芽，再通过维管组织联系而形成完整植株。4）仅形成芽或根。芽是外起源，根是内起源。3. 器官发生的生理与分子基础（了解）。二、体细胞胚胎发生与植株再生体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）：指体细胞培养物在适宜培养条件下形成类似于合子胚的结构，进而发育成完整植株的过程。经体胚发生形成的类似于合子胚的结构称为体细胞胚或胚状体（embryoid），或不定胚。花粉胚：由小孢子或者其分裂产物等单倍体细胞产生的胚状体，发育成单倍体植株。合子胚：植物通过自然受精作用而形成的受精卵/合子，经历原胚、球形胚、心形胚、鱼类形胚和子叶形胚发育而成的胚。1. 体胚与合子胚的比较无胚乳或胚乳/子叶发育不良；无种皮；物质积累少；质量差，萌发率低；一般体胚的干燥和休眠过程短暂或缺乏。2. 体胚发生的方式/途径1）直接发生：从外植体切口处或表面直接诱导分化出体胚。2）间接发生：从愈伤或悬浮培养的胚性细胞分化形成。3. 体胚发生的生理与分子基础（了解）。4. 胚状体与不定芽的区别及其优点组织学区别：1）胚状体有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。2）胚状体有生理隔离：其维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往与愈伤或外植体的维管组织相连。3）胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形，而不定芽无此现象。体胚再生途径的优点：1）数量多、速度快、成苗率高；2）可制成