亲和纯化--高等生物分离工程讲座PPT.ppt

亲和纯化,高等生物分离工程,一、亲和层析 (一)亲和层析的原理 (二)亲和层析的特点 (三)亲和层析的基本概念 (四)亲和层析的基本操作 (五)亲和层析的应用与实例 二、金属鳌合层析 三、亲和膜,本章主要内容,酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等） 抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白， 凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体） 核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白） 细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。,亲和层析 Affinity Chromatography,许多物质都具有和某化合物发生特异性 可逆结合的特性,亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物 质可逆性特异结合的化合物（称配体或配基）连接 到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱， 当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大 分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其 他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生 物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离 提纯的目的。,（一）亲和层析的原理,配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,交联试剂,载体,配体,载体与配体交联体,杂质,游离配体,亲和的一对分子中的一方以共价 键形式与不溶性载体相连，作为固定相吸附剂 当含有混合组份的样品(流动相)通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出 然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来,(一)亲和层析的原理,亲和结合包括以下几个方面的相互作用: 静电作用 亲和作用分子对的结合部位上带有相反电荷时,产生静电引力。 氢键 如果亲和作用分子对的一方分子中含有氧原子或氮原子,结合部位之间可以产生氢键作用。 疏水性相互作用 如果亲和作用分子对的一方分子上含有芳香环或烃基链等疏水基,另一方的结合部位上也含有疏水区,则两者之间可发生疏水性相互作用。 配位键 如果亲和作用分子对均与同一金属原子配位,则两者之间可以通过金属配位键间接结合。 弱共价键 结合力较弱的可逆共价键。,(一)亲和层析的原理,(二)亲和层析的特点,纯化过程简单、迅速，且分离效率高,纯化倍数大，产物纯度高,必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件,特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子,亲和层析载体的选择 具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过 具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速 具有惰性，尽量减少非专一性吸附 具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价和偶联 在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性,(三)亲和层析的基本概念,亲和层析载体的性质与选择,常用的亲和层析载体,纤维素,葡聚糖凝胶,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,多孔玻璃珠,1）纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料，取材十分方便。但由于其结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有关的物质。 2）琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。,常用的亲和层析载体,亲和层析载体的性质与选择,3）葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小，特别是经配基偶联后，凝胶膨胀度会进一步变小，所以应用受到限制。 4）聚丙烯酰胺凝胶：碳碳骨架，由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，具有网状三维空间结构。注意避免接触强氧化剂，配基偶联后会使它的网格缩小，在一定程度上限制了它的应用。,常用的亲和层析载体,亲和层析载体的性质与选择,5）多孔玻璃珠：化学和物理稳定性好，机械强度高，不但能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应条件。缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。 改良方法：用葡聚糖包被玻璃珠，则可改善其亲水性并增加化学活性基团。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在DNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNA和RNA聚合酶。,常用的亲和层析载体,亲和层析载体的性质与选择,纯化对象和配体之间必须有较强的亲和力 但亲和力太高也是有害的，因为在解离配体复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 配体必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配体与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配体与生物分子之间的亲和力,亲和层析配体的性质与选择,亲和层析配体的选择,亲和层析配体的性质与选择,配体的偶连,酸酐法,N-取代羟基琥珀酰亚胺法,叠氮化作用,还原性烷基化合物（西夫碱）的形成,1, 非特异性洗脱 通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度等使与固定配体结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广泛的是改变溶液的离子强度。 非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配体形成复合物，使固定化的配体对相应的生物大分子的亲和力降低。,(四)亲和层析的基本操作,2, 特异性洗脱 使用特异的配体作为洗脱剂 使用含有与亲和配体或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配体或目标产物的竞争性结合来洗脱目标产物,(四)亲和层析的基本操作,3, 特殊性洗脱 亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配体与载体的连接键，获得的配体-蛋白络合物后，再除去配体。实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法。,(四)亲和层析的基本操作,1,一步洗脱 属于非选择性洗脱方法，应用于高度特异性吸附剂 的结合，经过一次洗脱将被吸附物质全部洗脱下 来，就可得到较纯的分离物。 非选择性洗脱主要受洗脱液的pH、离子强度、温度 和介电常数等因素的影响，有效的洗脱液既能改变 被吸附蛋白质的构象以降低蛋白质与配基之间的亲 和力，又不破坏蛋白质和亲和吸附剂的稳定性。,2, 分步洗脱： 属于选择性洗脱方法，应用于基团特异性吸附剂，亲和吸附 剂上吸附有特异性不尽相同的多组分样品，用几种不同的洗脱条件分几步洗脱，可以将亲和力大小不同的组分分开。 3, 梯度洗脱： 属于选择性洗脱方法，利用洗脱液的浓度梯度变化，即解吸附能力逐渐增强，对吸附性质相同、特异性程度不同的酶和同工酶有效地洗脱。梯度洗脱比分步洗脱更有可能得到较纯的分离对象。此方法需要有梯度混合仪来实现洗脱液的梯度变化。,(四)亲和层析的基本操作,(四)亲和层析的基本操作,1,温度,2,抑制氢键形成的物质,3,离子强度,pH,4,影响亲和层析的主要因素,(三),5,鳌合剂,1,离子强度,如果亲和作用主要源于静电引力,则提高离子强度 无疑会减弱甚至完全破坏亲和作用。 氢键的形成同样基于静电引力,因此提高离子强度也会降低或消除氢键作用。 疏水性相互作用随离子强度提高而增大。 许多亲和吸附的目标蛋白可用高浓度盐溶液洗脱,说明静电引力在亲和作用中占有重要地位。,由于温度升高使得分子和原子的热运动加剧,结合部位的静电作用、氢键以及金属配位键减弱,但可使疏水性相互作用增强。,温度,2,抑制氢键形成的物质,3,脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成。但是,脲和盐酸胍是蛋白质的强烈变性剂,高浓度下容易引起蛋白质的变性失活。,pH,4,蛋白质多为两性电解质,含有许多解离基团,不同解离基团的解离常数不同。 如果静电引力对亲和作用的贡献较大,则pH将严重影响亲和作用,即在适当的pH下亲和作用效果较强,而在其他pH下亲和结合作用减弱或完全消失。 在亲和分离操作中,溶液pH值的选择是非常重要的。,5,鳌合剂,如果亲和作用源于分子与金属离子形成的配位键,则加入乙二胺四乙酸(EDTA)等鳌合剂可去除金属离子,使得亲和作用消失。,1, 抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离 的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和 层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。,(五)亲和层析的应用,抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数 108-1012 M，所以洗脱时是比较困难的，通常需要 较强烈的洗脱条件。,2, 激素和受体蛋白 激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力(10-6 _1012M)而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。 目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。,(五)亲和层析的应用,3, 凝集素和糖蛋白 凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物 中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各 种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。,(五)亲和层析的应用,用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。,4, 多核苷酸和核酸 利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。poly-A可以用于分离RNA聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。 以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。,(五)亲和层析的应用,5, 辅酶 核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。 例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。,(五)亲和层析的应用,6, 分离病毒、细胞 利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析 也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等 作为配体都可以用于细胞的分离。 例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞， 胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。,(五)亲和层析的应用,实例1:亲和层析法制备谷胱甘肽S-转移酶(GST),GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用。 GST催化这些带有亲电中心的疏水化合物与还原型谷胱甘肽（GSH）的亲核基团GS反应，中和它们的亲电部位，使产物水溶性增加，经过一系列代谢过程，最后产物为巯基尿酸，被排出体外，从而达到解毒目的。 亲和层析利用GST和其底物GSH的特异性结合来进行GST的分离纯化。,缓冲液A：0.025 mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3 mmol/L二硫苏糖醇（DTT），1 mmol/L EDTA，0.2 mol/L NaCl 缓冲液B：0.025 mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L GSH，2mmol/L DTT 注：根据酶的性质在分离纯化过程中需要加入适量的金属鳌合剂、还原剂等，以保持酶的活性。,所需试剂,1. 亲和层析介质Sepharose 4B-GSH的制备： Sepharose 4B在碱性条件下，加入环氧氯丙烷和二氧六环活化将GSH偶联到载体上，制成专一吸附剂。 2. 亲和层析柱的准备： 装柱:柱床体积约4-6 mL（柱高约2-3 cm），连接蛋白监测系统，用Buffer A平衡（约10-20 mL），至记录仪基线平稳。 3. 上柱样品的准备： (1) 按照两组4 g兔肝，剪碎，加入约10倍组织重的Buffer A，用组织捣碎机匀浆。 (2) 匀浆液先用低速离心机离心10 min，弃沉淀，上清再次离心 （4，100000 g，40 min），弃沉淀，滤纸过滤上清液。,实验步骤,4. 亲和层析柱分离GST： (1)上柱：将滤液上柱，流速约 4-5秒1滴。 (2)平衡：用Buffer A洗去杂蛋 白至柱中介质变白，记录仪 回到基线 (3)洗脱：用Buffer B洗脱，流 速约4-5秒1滴，收集洗脱峰 (约5mL)分装冷冻。,实例2:色素亲和层析,三嗪类色素配基的特点是化学稳定性高,价格便宜,适用范围广,亲和结合力适中,蛋白质容量大。因此,色素亲和层析的操作成本低廉,有很高的实用价值。 基于色素的蛋白质结合作用与盐浓度的关系,色素亲和层析的吸附操作通常在低盐溶液中进行。 用相同的低浓度盐溶液清洗后,通过逐次或线性提高盐浓度的梯度洗脱法洗脱目标产物。,色素亲和层析纯化脱氢酶: 1)取3 L 菌体细胞抽提液,用低浓度盐溶液A清洗,除去未吸附的杂蛋白。 2)逐次用高浓度盐溶液B和辅酶溶液C洗脱,分别获得羟基酪酸脱氢酶(3-HDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)活性峰。 3)收集3-HDH活性部分超滤浓缩到200 mL 后透析脱盐。 4)再加入到另一个色素亲和柱,二次纯化。 经过两次纯化,3-HDH比活提高213倍,第一步34.4倍,第二步6.2倍,最终收率为78% 。 (孙彦生物分离工程P209),利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配 基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相 上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨 酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用 而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。,金属螯合层析 (Metal Chelating Chromatography),用基因工程的手段表达蛋白质，必需经过纯化才能实现最终目的。 不同性质的蛋白质纯化条件各不相同太难摸索，这一点和核酸相差甚远，所以将目的蛋白和一个亲和纯化标签融合表达，通过亲和纯化Tag蛋白来纯化目的蛋白，就成为常用的迂回手段。,实例2:His-Tag融合蛋白,6组氨酸与Ni-NTA的结合是不受构象影响的,在天然或变形的条件下进行一步纯化,使用的是温和的洗脱液环境，结合、洗涤和洗脱步骤不会对蛋白结构产生影响. 6组氨酸标签比普通的标签(Tag)要小得多，纯化后蛋白可以直接进行下游操作。 6组氨酸可以用于任何表达系统，包括:细菌、杆装病毒和哺乳动物。 6组氨酸标签在生理溶液pH下不带电荷，标签不会干涉重组蛋白的结构和功能。 6组氨酸标签免疫原性差，重组蛋白可以不需要除去标签直接作为抗原进行免疫。 利用Xa因子蛋白酶可以方便地将6组氨酸标签有效地切除,去除标签的蛋白可以用作晶体成像或者核磁共振研究。,His-Tag的独特优势,Ni-NTA亲和层析纯化His-Tag融合蛋白,该通用系统可在温和、非变性条件，或存在6 M 胍或尿素条件下纯化蛋白。最终在2.5 mL的介质中可获得高达20 mg的目的蛋白。,纯化基本步骤,His Tag 序列