实训三、纤维素酶活力的测定与稀释浓度的测定(完).doc

实训三、纤维素酶活力与最佳稀释浓度的测定一、实训目的1、了解纤维素酶活力的测定原理2、掌握纤维素酶活力的测定方法3、优化纤维素酶的稀释浓度，为后续实训创造条件二、实训原理纤维素酶在一定的温度和PH条件下，能够将纤维素底物（羧甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖可以与DNS试剂发生显色反应，反应液颜色的强度（吸光度OD值）与酶解产生的还原糖量成正比关系，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，可以通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。三、实训方法1、纤维素酶酶活的定义（根据中华人民共和国轻工行业标准QB2583-2003和中华人民共和国农业行业标准NY/T912-2004）：1g固体酶（或者1ml液体酶），在50（预设），PH4.8（预设）的条件下，1h水解羧甲基纤维素钠底物，产生相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以U/g(或者U/ml)表示。简写成CMCA-DNS（羧甲基纤维素酶活力）。2、还原糖法测定纤维素酶活力21 试剂的配制（1）005mol/L PH4.8的柠檬酸钠缓冲液：称取一水柠檬酸钠4.83g,溶于约750mL水中,在搅拌的情况下,加入柠檬酸三钠7.94g,用水定容到1000mL,调节PH到(4.8+0.05)备用。(2) CMC-Na溶液:称取2gCMC-Na,精确至1mg,缓缓加入相应的柠檬酸钠缓冲液约200mL,并加热到8090,边加热边磁力搅拌,直到全部溶解(不要沸腾!),冷却后用相应的缓冲液稀释到300mL,用2mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液PH到(4.8+0.05),最后定容倒300 mL,搅拌均匀,贮存到冰箱中备用。(3)DNS溶液:具体配制见实训一。2.2 样品的测定2.2.1待测酶液的制备 称取固体酶样1g,精确到0.1mg(或吸取1.0mL酶液,精确到0.01mL),用水溶解,准确稀释定容成100,500,1000,2000,从中选取一个合适的稀释度,最终使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.330.35范围内),混匀放置10min,待测。2.2.2 实训操作过程(1)取四支25mL刻度具塞试管(一支空白,三支样品管平行)；(2)分别向四支管中准确加入已经在50条件下预热了5min的用相应PH缓冲液配制的CMC-Na溶液(底物)2.00mL；(3)分别准确加入已经在50条件下预热了5min的稀释的待测酶液0.50mL于三支样品管中(空白管不加),充分混匀,盖塞；(4)将四支试管同时放入(50+0.1)水浴中,准确计时,反应30min,取出；(5)迅速准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL,于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5mL,充分摇匀.将四支试管同时放入沸水浴中,准确计时,加热10min,取出,迅速用流动冷水冷却至室温,用蒸馏水定容至25mL；(6)以空白管调节仪器零点,在分光光度计波长540nm下,用10mm比色杯,分别测量三支样品管样液的吸光度,取平均值.通过查标准曲线或用线形回归方程求出还原糖的含量。四、结果记录与分析处理1、纤维素酶活计算2、三根样品管要求每根测定两次，任意两个数据之间的绝对差值不得超过算术平均值10%，变异系数不超过10%。完整记录下全部原始数据。3、根据要求判断出最