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生物学导论实验,实验一 真核细胞的显微观察 指导教师: 刘芳 2008.5,第一部分：普通光学显微镜 的结构和使用,光学显微镜由三部分组成：机械部分、光学部分和照明部分。 1机械部分：镜座(base)；镜柱(pillar)；镜臂(arm)； 镜筒(1ighttube)；载物台(stage)； 物镜转换器(旋转盘)(nosepiece)； 调节器(regulator)。 2照明部分：反光镜(reflecting mirror)；聚光器(condenser)； 光圈(aperture)。 3光学部分：目镜(eyepieces)： 5X、10X、15X等。 物镜(objectives)：低倍镜有10X或15X， 高倍镜有40X或45X标志。 油镜上一般为100X。,（一）普通光学显微镜的构造,放大倍数： 工作距离:,低倍镜 (10x) 7mm 高倍镜 (40x) 0.5mm 油镜 (100x) 0.2mm,实物放大倍数 = 物镜放大倍数目镜放大倍数,（二）显微镜的使用方法,1低倍镜的使用 （1）取放：右手握镜臂，从镜箱内取出显微镜，左手托镜座，轻轻放在实验桌上。先检查一下显微镜各部件有无损坏，如发现有损坏或性能不良者，立即报告教师请求处理。 （2）准备：将显微镜放于前方略偏左侧，必要时使镜筒倾斜（有的显微镜本身已经倾斜）以便观察。 （3） 转动粗调节钮，将镜筒略升高（或将载物台下降）使物镜与载物台距离拉开。 （4）放标本片：标本片的盖片朝上，将标本片放到载物台前方，然后推到物镜下面，用压片夹压住，如有标本移动器，可用上面的弹簧夹夹住标本片，然后把要观察的部分移到通光孔的正中央。 （5）旋转物镜转换器，将低倍镜对准载物台中央的通光孔（可听到“咔哒”声）。 (6)对光：打开电源，上升聚光器，双眼同时睁开，以左眼向目镜内观察，同时调节反光镜的方向，直到视野内光线明亮均匀为止(可以调节亮度旋钮）。 (7)调节焦距：从显微镜侧面注视物镜镜头，同时旋转粗调节钮，使镜筒缓慢下降（或镜台上升），大约低倍镜头与玻片间的距离约5mm时，再用左眼从目镜里观察视野，左手慢慢转动粗调节钮，使镜筒缓缓上升，直至视野中出现物像为止。如 物像不太清晰，可转动细调节钮，使物像更加清晰。 (8) 使用结束后, 将所用标本取下，将亮度旋钮调至最小即目镜内光线最暗时关闭电源，再将物镜旋成八字形，盖上镜罩，送回镜箱。,2高倍镜的使用 （1）依照上述操作步骤，先用低倍镜找到清晰物像。 （2）将需要观察的部分移到视野的中央。 （3）眼睛从侧面注视物镜，用手移动转换器，换高倍镜。 （4）眼睛向目镜内观察，同时微微上下转动细调节钮，直至视野内看到清晰的物像为止。,3油镜的使用方法 （1）先按低倍镜到高倍镜的操作步骤找到物像，把要放大观察的部分移到视野中央。 （2）把高倍镜移开，在标本片上滴一滴香柏油，眼睛从侧面注视镜头，轻轻转换油镜，使镜面浸在油滴中。在一般情况下，转过油镜即可看到物像，如不清楚，可来回调动细调节钮，即可看清物像。如仍看不清，应按上述步骤可重作。 （3）找到物像后，再调节聚光器和光圈，选择最适光线； （4）油镜使用完毕后，上升镜头约l0mm，把镜头转到边，用擦镜纸把镜头擦净。如仍擦不干净，可用擦镜纸蘸少许二甲苯轻擦，然后再用干净的擦镜纸擦一遍。 （5）有盖片的标本片，可用擦镜纸蘸少许二甲苯，把油擦净。无盖片的标本片，可用拉纸法擦油。方法是：先把一小张擦镜纸盖在油滴上，再滴上二甲苯，平拉擦镜纸，反复几次即可擦净。也可以在二甲苯中把油洗去晾干。,（三）使用显微镜的注意事项,（1）取显微镜时必须右手握住镜臂，左手托镜座，切勿一手斜提，前后摆动，以防镜头或其他零件跌落。 （2）观察标本时，显微镜离实验台边缘应保持一定距离（5cm），以免显微镜翻倒落地。镜柱与镜臂间的倾斜角度不得超过45，用完立即还原。 （3）使用时要严格按步骤操作，熟悉显微镜各部件性能，掌握粗，细调节钮的转动方向与镜筒升降关系。转动粗调节钮向下时，眼睛必须注视物镜头。 （4）观察带有液体的临时标本时要加盖片，不能使用倾斜关节，以免液体污染镜头和显微镜。 （5）粗、细调节钮要配合使用，细调节钮不能单方向过度旋转，调节焦距时，要从侧面注视镜筒下降，以免压坏标本和镜头。 （6）用单筒显微镜观察标本，应双眼同时睁开，左眼观察物像，右眼用以绘图，左手调节焦距，右手移动标本或绘图。 （7）禁止随意拧开或调换目镜、物镜和聚光器等零件。 （8）显微镜的光学部件不可用手指、纱布、手帕或其他粗糙东西擦拭，以免磨损镜面。需要时只能用擦镜纸擦拭。 （9）凡有腐蚀性和挥发性的化学试剂和药品，如碘、乙醇溶液、酸类、碱类等都不可与显微镜接触，如不慎污染时，应立即擦干净。 （10）实验完毕，要将玻片取出，用擦镜纸将镜头擦拭干净后移开，镜头不能与通光孔相对。用绸布包好，放回镜箱。切不可把显微镜放在直射光线下曝晒。,第二部分：真核细胞的显微观察,基础知识,生物细胞可分为原核细胞和真核细胞两大类。原核细胞由细胞膜、细胞质和核物质等部分组成，不具有典型的细胞核结构及多种细胞器，如细菌细胞。真核细胞由原核细胞进化而来，其内部结构与机能更复杂和多层次化。在结构上，真核细胞突出表现为以膜系统的分化为基础，形成了有膜包围的典型细胞核和结构与功能更专一的多种细胞器，如线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体、叶绿体及液泡等。并且，构成真核生物的真核细胞种类繁多，形态各异，其形态的多样性又与机能密切联系。,细菌细胞结构,植物细胞结构模式图,动物细胞结构模式图,实验目的 1了解真核细胞各种各样的细胞形态，及形态与机能的关系，理解细胞是生命体结构与生命活动的基本单位。 2了解真核细胞与原核细胞结构的异同点。 3学习临时装片方法及一些染色方法。 4. 学习和掌握显微镜的使用方法。,实验材料 人口腔黏膜细胞、 洋葱鳞茎、洋葱根尖、新鲜菠菜叶,（一）动物细胞的结构,1. 口腔黏膜细胞涂片标本的制备与观察 （1）人口腔黏膜细胞临时涂片标本的制备 吸取碘液一滴在一干净载玻片中央，将消毒牙签粗的一端伸入口腔，在口腔颊内壁上轻轻刮取黏膜上皮细胞，将刮下的白色粘性物质放入载玻片上的染液内，分散均匀。染色2min后，加盖盖玻片，即用镊子夹取盖玻片的一侧，将另一侧边缘先接触载玻片上染液，然后将整块盖玻片慢慢盖上，注意两玻片之间不要有气泡。若盖玻片周围的染液过多，可用吸水纸吸去盖玻片边缘多余的染液。,（2）观察 将以上制备的标本片置显微镜载物台上，有盖玻片的一面向上。用标本移动器的卡片卡紧，并转动标本移动器的螺旋，移动标本片，使待观察的材料处于物镜正下方。在低倍镜下，可见人口腔黏膜上皮细胞呈扁圆形或扁平多边形。再寻找较分散、轮廓清晰的单个细胞，移至视野中央转高倍镜观察。高倍镜下可见细胞外仅有一大致可辨的细胞界限，即细胞膜。细胞核扁圆形呈鲜红色（如用碘液染则为深黄色），位于细胞中央或近中央，细胞质浅红色（或浅黄色）。,（二）植物细胞的结构,1洋葱鳞茎表皮细胞临时装片标本制备与观察 （1）临时装片的制备 取一干净载玻片，滴一滴碘液在玻片中央。用尖头镊子从洋葱肉质鳞片内表面撕下一小块膜质表皮，平铺在载玻片的碘液滴上，用解剖针将其轻轻压入液滴中，使之展开，盖上盖玻片（操作同上）。用吸水纸吸去盖玻片周围多余的碘液。,（2）观察 将制备好的装片标本置显微镜下观察。先用低倍镜观察，可见许多长柱状细胞排列整齐，彼此相连。选择其中一个较典型的细胞移至视野中央，再转高倍镜观察。 在高倍镜下可见细胞最外面为一层棕黄色较厚的结构，即细胞壁。细胞壁以内是着色较浅、近于透明的细胞质。细胞质内有一个或几个、或大或小的透明的液泡，在细胞中央或靠近细胞壁，有一个椭圆形细胞核。调节细调螺旋，可见核内有12个染成棕黄色、折光较强的核仁。细胞质外围有一薄层细胞质膜，但在光镜下不易分辨。,2洋葱根尖细胞形态的观察： （1）根尖培养：取洋葱鳞茎，剪去老根，置于盛有清水的培养皿中，使部分鳞茎浸入水中，室温（25）或放25左右的温度下培养，23d后，鳞茎长出不定根。 （2）观察根尖的形态。取一干净载玻片，滴12d碘液（或改良苯酚品红染液）在玻片中央，取一段根尖放于碘液中，放好盖玻片，然后用指头把根尖压扁制成压片标本观察，或者用洋葱根尖切片标本观察。区分根冠区、分生区、伸长区的不同形态细胞,3菠菜叶肉细胞的观察 取一新鲜菠菜叶片，用镊子撕去一小块下表皮，用小刀轻轻刮取表皮以内的叶肉细胞，置于载玻片的水滴中，分散均匀，盖上盖玻片，制成菠菜叶肉细胞临时装片标本。将所制标本装片置显微镜下，先用低倍镜再转高倍镜观察，注意叶肉细胞内叶绿体的形态和数目。,（三）动植物不同组织装片标本的观察 玉米根尖纵切装片 洋葱表皮细胞装片 3. 单层扁平上皮细胞,实验 2 叶绿素a的提取和 叶绿素a的的特征光谱分析,叶绿体及其色素,一. 叶绿体的结构,叶绿体是植物细胞所特有的细胞器，与其他质体不同，它带有绿色，从而，使含有大量叶绿体的一切植物器官均呈现绿色。 从绿藻到高等植物的绿色细胞都含有叶绿体。叶绿体的形状随植物的种类而异。藻类的叶绿体往往呈螺旋状、杯状、环状和星状等；高等植物的叶绿体大多数呈椭圆碟形小颗粒状（直径约410微米，厚约13微米）。 叶绿体在绿色细胞中的数目不仅随物种而异，而且受生态条件的影响颇大。例如，在藻细胞只有一个叶绿体，星接藻有两个，而高等植物则最多，每个叶肉细胞中有20100个或更多。,类囊体是叶绿体中执行光能吸收与转化的场所，因此，人们常称它为光合膜。类囊体由一层单位膜组成，形成一个个扁平的小囊，也有人称之为囊片。类囊体的分布是不均匀的，表现出两种不同的组合，一种叫基粒片层或基粒膜，另一种叫间质片层或间质膜。基粒常由10100个类囊体垛迭而成，好象一串小镍币，直径约0.32微米，在一个典型的叶绿体中约有4060个基粒。,叶绿体色素,各种植物叶绿体中所含的色素有数十种，可分三大类：叶绿素类、类胡萝卜素类和藻色素类（或称藻胆素类）。后一类只存在于藻类。以下介绍前两类。,（一）叶绿体色素的化学特性,1叶绿素类 高等植物叶绿体中含有两种叶绿素，即叶绿素a与叶绿素b。它们不溶于水，而溶于酒精、丙酮、乙醚、乙烷等有机溶剂。叶绿素a和b分别呈蓝绿色与草绿色，两者结构上的差别仅在于第吡咯环上的一个CH3被CHO所取代。它们的分子式分别表示如下：,现将它们的结构式介绍如下：,2 类胡萝卜素,高等植物叶绿体,胡萝卜素,叶黄素,存在于叶片、果实、花冠、花粉等有色体中;,不溶于水，而溶于有机溶剂。,胡萝卜素又分-、-和-胡萝卜素三种同分异构体,胡萝卜素衍生的醇,在叶片内叶黄素含量往往超过胡萝卜素含量，其比值约为2：l,含量最多、对光合作用最重要,C40H56,C40H56O2,（二）叶绿体色素的吸收光谱,在乙醚提取液中，叶绿素a和b在蓝紫光波段有两个吸收峰，最大吸收峰分别在429与453毫微米，而较小的吸收峰分别位于410和430毫微米。此外，在红光波段也有一个吸收峰，分别为660和642毫微米。叶绿素a的红光吸收峰比叶绿素b的高，而蓝紫光吸收峰则低于叶绿素b。,410nm,429nm,430nm,453nm,660nm,642nm,（对不同波长光线的吸收能力，反映了分子内部结构的差异） -胡萝卜素与叶黄素在分子结构上也存在着细微的差异。这种差异在它们的吸收光谱上得到反映。,1 叶绿素的提取,（叶绿素是一种极不稳定的化合物，在光照、高温和叶绿素酶存在等条件下，叶绿素分子很容易降解。因此，提取、分离和分析测定叶绿素的过程要尽量在弱光、低温条件下进行，最好能在较短的时间内完成全部实验）。 弱光下称取螺旋藻藻粉3份，每份0.01 g，分别放入3个研钵中，每个研钵都加入少许MgCO3，第一个研钵加入5 mL无水甲醇，第二个研钵加入5 mL乙醚，第三个研钵加入5 mL 90丙酮。研磨抽提5min，转入离心管中，加入相应的溶剂反复润洗（转移干净），离心管中有机溶剂共计10 mL即可，离心（3000rmin，10min），取上清液。 称取干净的菠菜或其他叶片0.2g，剪碎后放入3个研钵中，参考上述螺旋藻的步骤提取叶绿素。,2吸收光谱分析,各提取液分别加入到光径为 l cm的比色皿中，以对应的溶剂作为空白对照，立即在紫外可见分光光度计上测定各色素提取液的吸收光谱，设定波长为510，520, 560，600，620, 640，650, 663，670，700nm，记录各波长下的吸光度（OD值）。 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制色素的特征吸收光谱。,3藻类细胞中叶绿素a浓度分析,测定螺旋藻色素溶液在663 nm处的光吸收值（OD663），溶液中叶绿素a浓度可参考以下经验公式计算： 叶绿素a浓度gmL13.9OD663,分光光度计是种由光源、单色器、样品室、检测器及显示器等部分组成的测定物质光学特性的仪器。调节分光光度计可设置测定的波长范围、灵敏度等测量参数，现代制造的高级分光光度计可借助于计算机控制，完成对色素的测定和吸收光谱图绘制的全过程。,图 分光光度计工作原理示意图,实验要求 1了解叶绿素的化学性质，掌握用有机溶剂 提取、分离叶绿素的方法。 2认识和了解紫外可见分光光度计，了解 其工作原理，掌握其使用方法。 3学会用紫外可见分光光度计测定叶绿素 a的实验方法，认识叶绿素a的吸收光谱特征。,实验作业： 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘制螺旋藻、菠菜在不同溶剂中色素的特征吸收光谱(绘制三张光谱图，三种溶剂提取液各绘制一张）。并对各图作出结果分析与讨论。 计算螺旋藻中的叶绿素a浓度。,实验3 凯氏定氮法总氮 含量的测定,到来的同学请注意： 四人一组； 开始研磨混合催化剂（硫酸铜和硫酸钾），每组一份。,【实验原理】 将材料与浓硫酸共热，硫酸分解为二氧化硫、水和原子态氧，并将有机物氧化分解成二氧化碳和水； 而其中的氮转变成氨，并进一步生成硫酸铵。 为了加速有机物质的分解，在消化时通常加入多种催化剂，如硫酸铜、硫酸钾和硒粉等。 消化完成后，加入过量的NaOH，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3导入过量的硼酸溶液中; 再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。 滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算，可得出含氮量。,以甘氨酸为例，上述反应如下： CH2NH2COOH + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 2NH3 +H2SO4（NH4）2SO4 （NH4）2SO4+2NaOHNa2SO4+2H2O +2NH3 2NH3 +4H3BO3 （NH4）2B4O7 +5H2O （NH4）2B4O7 +2HCl +5H2O 2NH4Cl +4H3BO3,【材料、仪器设备及试剂】 1材料 牛血清白蛋白 2仪器设备 凯氏自动定氮仪，红外温控定时消化炉，玻璃消化管、三角瓶、酸式滴定管。,3试剂 （1）浓硫酸（AR级） （2）%NaOH （3）混合催化剂：K2SO4：CuSO45H2O3：1，充分研细、混匀，贮于广口瓶中备用。 （4）混合指示剂：取200mL 01甲基红酒精溶液和50mL 01甲烯蓝酒精溶液混合，备用。本指示剂在pH5.2时为紫红色，pH5.4时为暗灰或褐色，pH5.6时为绿色，变色点pH为5.4，变色范围为pH 5.25.6，非常灵敏。 （5）2硼酸溶液：按100：1的体积比加入混合指示剂，摇匀后溶液呈紫红色即可。 （6）0.010 mol/L的标准盐酸溶液：（7）标准硫酸铵溶液（约含N 0.6 mg/mL）：,【实验步骤】 1样品处理 准确称取待测样牛血清白蛋白10mg，分别放入消化管中，准备1支空白消化管，然后给各管加入混合催化剂g，浓硫酸5 mL，置红外消化炉上，先在150200下加热0.5 h，继续升温到400，再消化0.5lh。直至溶液呈清亮透明。 待样品液冷凉后，在消化管内加入10mL蒸馏水稀释,用自动定氮仪进行蒸馏(设定加硼酸时间、加碱液时间分别为2秒、4秒），然后进行手动滴定(10-6-5:用13mL0.01mol/L盐酸)。,2样品测定 将的氢氧化钠溶液和配制好的硼酸溶液分别贮于固定的塑料桶中。 打开仪器的电源开关，通入冷却水以及供锅炉使用的无离子水，输入有关参数，放入已消化好的样品，即可自动蒸馏、手动滴定。 样品与空白蒸馏完毕后，一起进行滴定。选用微量酸式滴定管，加入0.010molL标准盐酸溶液进行滴定，直至三角瓶中硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡红色即为滴定终点，记录盐酸的用量。,3.计算： 含氮量： N（）=1.401MW(V-V0) 粗蛋白含量： P(%)=N(%)C M 标准酸摩尔浓度 W样品重量（克） V0空白滴定标准酸消耗量（毫升） V样品滴定标准酸消耗量（毫升） C粗蛋白转换系数(氮含量换算成pro含量的等数，历来采用6.25，这个数值是以pro平均含氮而导出的数值) 0.014-氮的毫克当量数,注意事项： 样品及催化剂加入消化管时，避免粘于管壁。 空白及样品滴定时，保证滴定终点的一致性。 消化管标签要贴稳. 消化管要求干净、干燥，清洗时防止损坏。 浓硫酸移取注意安全。 消化结束后，等待消化管冷却，直到不再有气体冒出时再去蒸馏滴定。 定氮仪使用中，蒸馏结束后，戴上较厚手套取下消化管，并及时用洗瓶冲洗通碱管、通硼酸管。,【思考题】 1 何为消化？如何判断消化终点？ 2 总结本实验“对照”的设置，各自意义何在？,作业： 绘制所观察的临时标本细胞的不同形态,实验4-5、血型,血涂片和染色体观察,一. 人类ABO血型检测 1原理：人类ABO血型由一组复等位基因控制，是红细胞血型系统中的一种，其红细胞表面有A和B两种抗原，血清中有A和B两种抗体。按照抗原和抗体存在情况，可以将人类的血型分为A、B、AB、和O等四种血型。 血型抗原在本质上是一种复合糖蛋白，它的合成受基因控制。人类中IA基因控制合成A抗原，IB基因控制合成B抗原，i基因不产生抗原， IA和IB对i均为显性。因此，IA、 IB和i三个复等位基因能组合成6种基因型，4种表型。,2方法 (1)取一清洁的载玻片用记号笔在两端分别用记号笔或胶布注明“抗A”和“抗B”， (2)采血：用75酒精棉球消毒受检者的指端，然后用消毒的三棱针(或弹簧刺针)刺破皮肤出血，取12滴血点在载玻片两端。 (3) 然后分别用吸管吸取抗A和抗B血清各一滴滴在载玻片血滴旁，再立即分别用牙签搅拌使血球和标准血清混匀，在室温中静置515分钟，观察血球凝集与否。混匀的血清如逐渐由混浊变为透明，出现大小不等的颗粒，表明红细胞已凝集；如仍呈混浊状，不出现颗粒，则没有凝集。有时因比重关系血球下沉团聚，貌似凝集，但只要稍加晃动又呈混浊状，为不凝集。如观察不清，可借光镜识别(低倍镜观察即可)。,受试者红细胞在抗A血清中发生凝集者为A型血，在抗B血清中发生凝集者为B型血，在两种血清中都发生凝集者为AB型血，都不发生凝集者为O型血。 (4)根据ABO血型检查的结果，判断血型。调查全班同学中A、B、AB和O型血出现的频率，并登记，计算各频率。,二. 血涂片观察,1 血涂片的制作 从采血针眼处挤出绿豆大小血滴，用清洁玻片面的一端轻轻接触血滴，使血滴附于玻片面上。 另取边缘平滑的玻片作为推片：以推片的一端放在血液的前方，逐渐后移，接触血滴并待血滴沿推片边缘均匀展开，然后将推片与玻片保持 30 45 度角，轻轻用力，均匀而迅速地将推片沿玻片表面推至玻片另一端，形成头体尾明显的舌形血膜。立即将玻片摇动，使其快速干燥，忌热力干燥。,推片方法,瑞氏 (wright) 染色 瑞氏染液，瑞氏染料 ( 伊红和美蓝 )0.1 克溶于纯甲醇 60m1 中。 缓冲液 (pH6.4 6.8) ， 1% 磷酸二氢钾 30ml 加 1% 磷酸氢二钠 20ml ，再加蒸馏水至 1000ml, 取已干燥的血涂片，用蜡笔在血膜两端划线，将血涂片放平 ( 置于染色架上 ) ，用滴管滴染液 3 5 滴于片上，并用滴管或吸球将染液驱散，使其布满整个血膜，放置约 30 秒钟。加入等量缓冲液，用吸球轻轻吹动，使染液与缓冲液充分混匀，放置染色约 5 10 分钟。然后用细小流水自片端冲去染液，切勿先倾去染液再用水冲。血片自然干燥后即可镜检。,一血液 血液（blood）约占体重的7，在成人循环血容量约5L。血液由血浆（plasma）和血细胞（blood cell）组成。从血管取少量血液加入适量抗凝剂（如肝素或枸橼酸钠）,有形成分经自然沉降或离心沉淀后，血液可分出三层：上层为淡黄色的血浆，下层为红细胞，中间的薄层为白细胞和血小板（图51）。血浆相当于结缔组织的细胞间质，约占血液容积的55，其中90是水，其余为血浆蛋白（白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原）、脂蛋白、脂滴、无机盐、酶、激素、维生素和各种代谢产物。血液流出血管后，溶解状态的纤维蛋白原转变为不溶解状态的纤维蛋白，于是凝固成血块。血块静置后即析出淡黄色清明的液体，称血清 .,血细胞约占血液容积的45%，包括红细胞、白细胞和血小板。血细胞分类和计数的正常值如下：,白细胞 白细胞为无色有核的球形细胞，体积比红细胞大，具有防御和免疫功能。成人白细胞的正常值为400010000个1。在疾病状态下，白细胞总数及各种白细胞的百分比值皆可发生改变。 根据白细胞胞质有无特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞两类。有粒白细胞又根据颗粒的嗜色性，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种。 血小板 血小板或称血栓细胞, 正常数值为10万40万1,(一)小鼠染色体,三. 染色体观察,(二)人类染色体,实验六 小白鼠的解剖,实验目的,1学习哺乳类动物的一般解剖方法，初步了解哺乳动物各器官系统的局部与整体的关系。 2通过对小白鼠外部形态和内部结构的观察，了解哺乳类的一般特征。,实验操作,（一）外部形态的观察 小白鼠整体分为头、颈、躯干、四肢和尾5部分，全身被毛。 1头部 长形；眼有上下眼睑；一对大而薄的外耳；鼻孔一对；鼻孔下方为口，口有肉质的唇。 2颈 颈部明显，活动自如。 3躯干 长而背面弯曲；腹部末端有外生殖器和肛门；雌体胸、腹部有较明显的乳头。 4四肢 前肢肘部向后弯曲，具5指；后肢膝部向前弯曲，具5趾；指（趾）端具爪。 5尾 尾长约与体长相等，有平衡、散热和自卫功能。,（二）处死和内部解剖 1颈椎脱臼法处死小白鼠 用左手拇指、食指捏住小白鼠头的后部，并用力下压；右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，便可使小白鼠的颈椎脱臼，瞬时死亡。,2解剖 （1）剪开皮肤 将处死的小白鼠腹面向上置于蜡盘中，用棉球蘸水擦湿腹中线上的毛。然后左手用镊子在外生殖器稍前处提起皮肤，右手持剪沿腹中线向前剪开皮肤，直至下颌底；再从四肢内侧横向剪开皮肤。一手用镊子提起剪开的皮肤，另一手将尖头镊子紧贴皮肤划剥结缔组织，以分离肌肉和皮肤。 （2）剪开腹壁 沿腹中线剪开腹壁至胸骨后缘，再沿胸骨两侧剪断肋骨，剪去胸骨，将肌肉向两侧展开用大头针固定。沿边缘剪开横膈膜及第一肋骨和下颌之间的肌肉。,（三）观察内部构造 1消化系统 （1）口腔 沿口角剪开颊部及下颌骨与头骨的关节，打开口腔。可见口腔底有肌肉质舌；小白鼠的上下颌各有2个门齿和6个臼齿；门齿发达，能终身不断地生长，可使磨损的门齿齿端得到补偿。注意观察门齿和臼齿的形态特征，它们各有何功能？异型齿是哺乳类的标志特征。 （2）肝脏 紧贴横膈膜下可以见到5叶红褐色的肝脏之一。 （3）胃 将肝脏掀至右边，可以观察到胃。 （4）食管 位于气管背面，后行穿过横膈与胃相接。 （5）肠 分为小肠和大肠。小肠分为十二指肠、空肠和回肠，十二指肠紧接胃，其后为空肠和回肠，回肠末端有盲肠，盲肠尖端为蚓突；大肠分为结肠和直肠，直肠进入盆腔，开口于肛门。 （6）胰脏 在十二指肠附近可以观察到粉红色的胰脏。,2呼吸系统 在颈部可以看到由白色环状软骨构成的气管；气管进入胸腔后分为左、右支气管，分别通入左、右肺。肺呈海绵状。 3循环系统 在胸腔可以见到略呈倒圆锥形的心脏位于两肺之间，心尖偏左，幼鼠心脏上半部被一对淡肉色的胸腺覆盖。将胃拨到右侧，可见其左侧红褐色长椭圆形的脾脏。,4泌尿生殖系统 （1）泌尿器官 将肠拨开，可见在腹腔背壁左右侧各有一豆形肾脏，右肾比左肾的位置略高，肾脏上方有淡红色的肾上腺。由各肾内缘凹陷处即肾门发出一输尿管，通入膀胱，膀胱开口于尿道。雌性尿道开口于阴道孔前方，雄性尿道通入阴茎开口于体外，并兼有输精功能。 （2）雄性生殖器官 将肠掀到一边，可以观察到：睾丸(精巢)一对，椭圆形，成熟后坠入阴囊。附睾一对，附睾可分为附睾头、附睾体和附睾尾，头部紧附于睾丸上部，体部从睾丸的一侧下行，尾部与输精管相接。输精管一对，开口于尿道。阴茎，为交配器官。 （3）雌性生殖器官 将肠掀到一边，可见在腹腔背壁两侧肾脏后方各有一个卵巢，近似蚕豆形。输卵管一对，盘绕紧密。输卵管前端呈喇叭状，在卵巢附近开口于腹腔，后端膨大为子宫，左右子宫会合延至阴道，阴道开口于体外，称阴道口。,结果与讨论 1、绘图：小鼠腹面解剖图（要求绘制心、肺、胸腺、膈肌、胃、肝脏、十二指肠、小肠、大肠在小鼠体内的相对位置并用文字注明） 2、小鼠排泄和生殖系统（雌或雄）相对位置并用文字注明 3、根据观察结果，归纳小白鼠有哪些形态结构表现哺乳类的进步性特征。,实验七 植物组织培养固体培养基的配制,一 实验目的： 1. 学习固体培养基的配制； 2. 掌握高压灭菌的原理及方法。 二 实验原理： 植物组织培养理论依据是植物细胞具有全能性。植物组织培养是指用无菌培养的方法，在人工制备的培养基上培养植物体的一个离体器官、离体的一种组织，或单个细胞，这些离体的器官组织，或单个细胞在无菌条件下不断生长，并经过转移，能够一代一代的延续生长下去，它的方法与微生动物培养技术相似，全部在人工控制下进行。组织培养技术内容是20年来已经从组织培养（组织块培养）发展到细胞培养、原生质体培养和细胞融合培养等等。并用之进行各种生理化及遗传操作研究。,三、实验剂试剂和设备 1试剂一MS培养基需要量mg/L,激素 IAA少量0.1Nna助溶液 10mg/10ml NAA少量95%乙醇助溶 10mg/10ml 2.4-D少量95%乙醇助溶 10mg/10ml IBA少量95%乙醇助溶 10mg/10ml KT少量INNHCL助溶 10mg/10ml BA少量INNHCL助溶 10mg/10ml 以上均先溶解在小烧杯中，待完全溶解后，用容量瓶定溶至所需的ml数，其中铁液，KT IAA保存在棕色瓶中，所有配好的药品均放入冰箱中保存，以免变质。,MS培养基1升中含有 大量元素母液 微量元素母液 微量元素母液Fe液 有机相（肌醇 烟酸 BV1 BV6 甘氨酸） 蔗糖 30g/L 琼脂（最后加入） 8g/1L-0.8% 激素（根据培养对象不同而异） 培养愈伤组织时，75ml培养基中加入 0.45ml 2，4-D(6mg/L) 0.225ml KT(3mg/L) 最终pH5.8,材料处理方法： 自来水冲洗15min-75%乙醇20秒-2%次氯酸钠10min-无菌水20min,每组准备器皿清单: 1. 200ml或250ml三角瓶3个+3张封口膜 2. 50ml-200ml烧杯5个+5张封口膜 3. 打孔器1套,大镊子1个,剪刀1把,手术刀1把,酒精灯1个,培养皿1套,玻璃吸管或玻璃棒1根,药钥1个,2设备： 烧杯、搅棒、容量瓶、量筒、移液管、三角瓶、（100ml）、培养皿、超净工作台（或无菌室）、冰箱、天平，高压菌锅、培养室（或培养箱）镊子、手术、手术剪、酒精灯，打孔器、滤纸、牛皮纸、橡皮圈、消毒棉,三 实验方法,1配制培养基的基本操作,11根据所配培养基的要求，从各母液只能感取出大量元素、微量元素、铁液、维生素、激素、蔗糖等，置于容量瓶中定容至100ml 12称取琼脂加入400ml置于大烧杯中加热时不断搅拌，十分钟后琼脂溶解，呈透明状即可，放置稍凉。 2溶解好的琼脂溶液中加入第1项中所取出的各物质及粮溶液100ml，不断搅拌使培养基混合均匀。,3用PH计或试纸测PH值，用INNaOH或INNCL调至5.8。 4将配制好的培养基分装于清洗干净，烘干的三角瓶中，培养基高度约1cm左右，琼脂约在40度时才凝固，所以有充足的时间业分装。 5将分装好的培养基的三角瓶中塞上棉塞，大小要合适，然后包上牛皮纸，用橡皮盘扎紧。牛皮纸上标以记号准备灭菌,6培养基的灭菌与保存。 培养基内含有丰富的营养物质，有利于细菌和真菌繁殖，所以培养基配好后要及时灭菌，用高压锅灭菌注意以下几点： （1） 检查锅内的水量，一般高度到支持锅座水平即可。 （2） 盖好锅盖，拧紧螺旋，然后检查排气阀是事通畅。 （3） 用煤气灶或电炉加热，当气压指针上升至6时，放一次气或打开放气阀，加热至锅内冒出大量热气，以排尽锅内空气。,（4） 高压锅内温度达1200C，0，1Mpa压力时，这时保持高压来菌20分钟，以后切断电源，是锅内压力自然慢慢下降，也可缓缓打开放气阀放气，使锅内压力接近于0（气压表指针下降至0），这时完全打开放气阀。 （5） 打开锅盖，取出培养基、灭菌水、培养皿、滤纸等。灭过菌的培养基通常置于100C下保存，待培养基放置23天后，瓶内水吸收干后即可使用。培养基灭菌后不宜久放，一般不超过一个月，多数情况灭菌后两周内使用完,3接种胡萝卜愈伤组织的培养。 接种，是指经过消素好的材料在无菌的情况下切成小块（外植体）并放入培养基的过程，要在无菌的环境中进行。接种进要求无菌操作，所有接种材料要预选消毒。 3.1提前15分钟将超净工作台打开过滤空气。