细胞生物学研究方法.ppt

1,第三章 细胞生物学的研究方法,郭兆峰 10生物工程 学号:104177306,2,第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞及其组分的分析方法 第三节 细胞培养与细胞工程 第四节 细胞及生物大分子的动态变化 第五节 模式生物与功能基因组的研究,学习内容,3,第一节 细胞形态结构的观察方法,一、光学显微镜(light microscopy) （一）普通复式光学显微镜 （二）相差显微镜和微分干涉显微镜 （三）荧光显微镜 （四）激光扫描共焦显微镜 （五）其他 二、电子显微镜(Electro microscopy),4,（一）普通复式光学显微镜,1. 构成： 光学放大系统：目镜与物镜 照明系统：光源和聚光镜 机械装置：镜架和样品调节系统 2. 原理：物体经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。,5,分辨率(resolusion)：区分两个质点间的最小距离。,其中: N=标本和物镜之间介质折射率； =入射光线波波长； =镜口角（样品对物镜镜口的张角） Nsin/2称为物镜的数值孔径,6,显微镜的几个光学特点： 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 sin /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400700nm，分辨力数值不会小于0.2m，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大设计倍数为1000X。,7,1.原理：利用光的衍射和干涉特性使相位差变成振幅差，表现为明与暗的对比。 2.两个特殊构件： 环状光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：涂有光吸收物质和相位推迟物质。,3.用途：能观察无色、透明、活细胞中的结构。,（二）相差显微镜,8,决定光学显微镜分辨率的要素：物镜的镜口角（），入射光的波长（ ），介质的折射率（N）,A 两束光的相位相同是，干涉使光的振幅加强 ，B 相位相反是，干涉使光的振幅减弱,9,1.原理：利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。,微分干涉显微镜,2.应用： 适于研究活细胞中较大的细胞器、颗粒及其运动。 计算机辅助的DIC分辨率比普通光镜提高了一个数量级。应用这一原理制备的录像增差显微镜（video-enhance microscopy）可以观察微管上颗粒的运动。,10,（三）荧光显微镜 Fluorescence microscope,1.原理：以紫外线为光源照射被检物体，使之发生荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在的位置。 2.特点：光源不直接照明，而是激发能源；需特殊的滤色镜；分辨率高。 3.用途：在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性、定位。 既可以观察切片，也可以进行活体观察。有免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。,11,荧光的基本原理及其应用,12,（四）激光扫描共聚焦显微镜,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描,形成立体图像，可重构样品的三维结构。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但可以排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率。,13,激光扫描共聚焦显微镜的原理,14,倒置显微镜,荧光共振能量转移技 (Fluorescence resonance energy transfer, FRET),(五)其他光学显微镜,荧光漂白恢复技术,15,二 电子显微镜,16,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。,（一） 原理,17,18,以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50120KV)的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构即小于0.2m、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构。,电子显微镜的优点,19,电镜与光镜的比较,20,（二） 主要电镜制样技术,1. 超薄切片技术,制作超薄切片流程： 固定 包埋 切片 染色,通常以锇酸和戊二醛固定样品， 丙酮逐级脱水， 环氧树脂包埋， 以热膨胀或螺旋推进的方式切片， 重金属（铀、铅）盐染色,22,2. 负染色技术,用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网 上的样品染色； 吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐， 而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,23,3. 冷冻蚀刻技术,亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜,24,25,4. 电镜三维重构与低温电镜技术,电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。,26,5. 扫描电镜技术,工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,27,扫描电镜原理示意图,28,三 扫面隧道显微镜,原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。,29,扫面隧道显微镜主要特点：,具有原子尺度的高分辨本领，侧分辨率为0.1到0.2nm，纵分辨率为0.001nm 可以在真空、大气、液体等多种环境下工作 非破坏性测量,30,第二节 细胞及其组分的分析方法,一 超离心技术分离细胞组分 二 细胞组分的细胞化学显示方法 三 特异蛋白抗原的定位与定性 四 细胞内特异核酸的定位与定性 五 定量细胞化学分析与细胞分选技术,31,一 超离心技术分离细胞组分,是分离细胞器及各种大分子基本手段。 转速为1025kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89K者称为超速离心机。 超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。,32,差速离心：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。,密度梯度离心：将分离的细胞组分放在密度逐渐增加、高溶解度性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面通过重力或离心作用使样品中不同组分以不同速率沉降。,速度沉降主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分 等密度沉降用于分离不同密度的组分,33,二 细胞组分的细胞化学显示方法,DNA：福尔根（Feulgen）反应紫红色 多糖类：PAS反应黄色 脂肪：苏丹III红色 蛋白质：米伦（Millon）红色,细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类等物质，利用一些显色剂与所检测物质中的一些特殊基团特异性结合，显现出颜色来判断含量和分布的技术,34,金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸。 联苯胺反应：过氧化酶分解H202，产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。,显示方法,35,三 特异蛋白抗原的定位与定性,1、免疫荧光技术 将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白在细胞内的分布。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。有直接免疫荧光和间接免疫荧光。,36,A 直接免疫荧光标记技术：将荧光分子与抗体欧联后直接用于免疫标记技术 B 间接免疫标记技术：先将抗体（称第一抗体）与抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗体（称第二抗体）。,37,2 免疫电镜技术,将样品进行特殊标记增强反差，从而进行亚细胞结构和分子的定位。 特点: 分辨率高 根据标记方法不同分为：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。,38,四 细胞内特异核酸的定位与定性,细胞内特异核酸的定位与定性通常采用原位杂交技术 原位杂交技术：用标记的核酸探针通过分子杂交确定 特异性核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法。,39,A 免疫胶体金标记技术原理示意图，细菌蛋白A可以与胶体金结合，也和与胶体的Fc端特异性结合 B免疫胶体金标记显示膀胱上皮细胞膜蛋白的分布,40,免疫胶体金技术： 胶体金是直径1-100mm的金颗粒分散在水中形成的金溶胶。 特点： 特异性强 容易识别 分辨率高,41,五 定量细胞化学分析与细胞分选技术,原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计,42,用途： 对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。,43,A 流式细胞仪分选原理示意图,B 显示流式细胞仪分析处在不同相的HaLa细胞的实验结果,44,第三节 细胞培养与细胞工程,细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要是利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、基因转移、细胞及组织培养等。目的是获得细胞产品或利用细胞本身。,45,（一） 动物细胞培养,原代细胞 ：110代以内的细胞,原代细胞的培养：,提取健康动物的组织块，剪碎 用浓度与活性适中的胰酶或胶原酶与螯合剂等将细胞分散 给予良好的营养液与无菌环境 在培养中进行慢速转动或静止培养 无论何种培养液都要加入一定量的小牛血清,46,贴壁培养：培养细胞贴壁生长，呈多态性，单层生长，保持接触抑制（contact inhibition），也叫单层细胞培养。,细胞系：能够传代40-50次并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制行为的传代细胞。,特点：有部分细胞遗传物质发生改变，有癌变的倾向,细胞株：经过生物学鉴定具有特殊遗传标记或性质的细胞克隆,47,连续细胞系（永生细胞系）：50代以后的 、遗传物质发生改变、能够无限制的的传代培养下去的,特点：染色体明显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体 失去接触抑制，容易传代培养,A 正在分裂的HeLa细胞 B 长满单层的CHO原代细胞,48,实验室中常用的几种连续细胞系,49,(二) 植物细胞培养,单倍体细胞培养： 花药在培养基上人工培养 小孢子直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株 通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株,原生质体培养： 除去细胞壁的细胞诱导分化长成植株 用不同的植物的原生质体进行融合与体细胞杂交，长成体细胞杂交植株,50,细胞工程,细胞工程基本技术主要包括： 细胞体外培养 细胞融合 细胞器移植及,细胞工程，就是应用细胞生物学和分子生物学的方法，对细胞进行操作。,51,细胞融合：两个细胞融合成一个双核或多核细胞核的现象 动物细胞融合：灭活病毒 (仙台病毒）或化学物质 (聚乙二醇 PEG)介导形成融合细胞。 植物细胞融合：先用纤维素酶去壁 电融合： 在高压电脉冲 (1-1.8kv/cm)下促使融合。,（一） 细胞融合与单克隆抗体技术,52,同核融合细胞：基因型相同的细胞形成的融 合细胞 异核融合细胞：基因型不同的细胞形成的融合细胞 融合核细胞：通过细胞杂交形成的单核子细胞,53,单克隆抗体：高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞。,1975年英国人Kohler和Milstein发明，因此获1984年诺贝尔奖。 原理：淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能无限分裂，而瘤细胞虽然可以在体外长期培养，但不分泌抗体。将这两种细胞融合得到的杂交瘤细胞具有两个亲本的特性，既能产生抗体又能无限增殖。,54,操作过程：,将小鼠的髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）在聚乙醇或灭活 的病毒介导下发生融合,55,融合后的杂交瘤细胞具有两种细胞的特性 一、可以分泌抗绵羊红细胞的抗体 二、像肿瘤细胞一样，可以在体外培养条件下或移植到体内无限增殖,单克隆抗体的主要优点：是可以用混合性的异质抗原制备出针对某单一性抗原分子上特异决定簇的同性质单克隆抗体。,56,（二）显微操作技术与动物的克隆,细胞拆合,物理方法：机械/短波光 去核移入去核的细胞中杂交细胞显微操作仪 化学方法：松胞素处理细胞离心拆分细胞核体外包一层细胞膜和少量胞浆（小细胞）PEG介导核体可同另一胞质体融合重组细胞可合成RNA和进行细胞分裂 结合胚胎移植技术直接应用于育种,第四节 细胞及生物大分子的动态变化,（一） 荧光漂白恢复技术（FPR）用亲脂性或亲水性的荧光分子与蛋白或脂质偶联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部的运动及其迁移速率,原理：利用高能激光束照射细胞的某一特定区域，使该区域内的标记分子发生不可逆的淬灭，称为漂白区，随着脂质分子或蛋白质的运动，漂白区逐渐恢复到原有水平,荧光漂白技术原理示意图,（二）单分子技术与细胞生命活动的研究,单分子技术是在细胞内实现观测单一分子运动规律的技术，可以在纳米空间尺度和毫秒时间尺度上精确测量单个分子的距离、位置、指向、分布、结构以及各种动态过程,分类：可以从工作原理或测量参数分类 以工作原理分成单分子光谱及成像、单分子操作及力学性质测量,优点：实时直接观测单个分子的反应动力学的途径 测量单一分子间相互作用力 捕捉单一分子随机过程和分子构象变化的中间态 测量稀发但重要的信号和分布 测量非平衡态和不同步的体系,（三） 酵母双杂交技术,酵母双杂交系统巧妙地利用了真核生物转录调控因子的组件式结构特征，因为这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域和转录激活结构域是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。,用于与检测蛋白质和蛋白质互做的酵母双杂交技术原理示意图,（四） 荧光共振能量转移技术,原理：在一定波长的激发光照下，只有携带发光基团A的供体分子可以被激发出波长是A的荧光，而同一激发光不能激发携带发光基团B的受体分子发出波长是B的荧光，当吸收光谱A和 吸收光谱B重叠，并且两个发光基团距离小到一定程度时会发生不同程度的能量转移，受体分子发出了波长是B的荧光,荧光共振能量转移原理图,（五） 放射自显影技术,原理：利用放射性同位素的电离射线对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究,步骤：选合适的放