植物组织培养的培养条件.doc

第三章 植物组织培养的培养条件第一节 植物组织培养的条件一、环境条件（一）温度培养温度对植物细胞生长及二次代谢产物生成有重要影响。通常，植物细胞培养采用25。1离体培养条件下的温度控制原则温度控制主要依据植物种的起源和生态类型来确定。将植物分为喜温性植物和冷凉性植物两大类。喜温性植物培养温度一般控制在2628比较适宜。冷凉性植物通常培养温度控制在1822或25较为适宜。一般温度低于15，高于35对植物细胞的分裂、分化不利。在细胞脱分化阶段（诱导期）和愈伤组织增殖期（分裂期），温度要求高一些，而在器官发生阶段（分化期）要求低些。2培养周期中的昼夜温差培养过程中采用恒温培养好，还是变温培养好呢？目前多数植物种，从器官到细胞培养均采用恒温培养。国内有关小麦、水稻花药培养温度试验报道认为：在诱导花药形成愈伤组织时，昼夜恒温较好，在器官分化时，昼夜具有一定温差比较好，分化出的小植株也健壮。3低温预处理有报道，花药离体培养前，实行低温预处理，可以促进植物细胞脱分化和再分化，已成为一项有效的诱导措施。特别在花药和花粉培养方面的研究报道相当多。（二）光照光对植物有着特殊的作用。光照射条件不仅通过光照周期、光的质量(即种类、波长)而且通过光照量(光强度)的调节来影响植物细胞的生理特性和培养特性。研究表明，光调节着细胞中的关键酶的活性，有时光能大大促进代谢产物的生成，有时却起着阻害作用。1光照强度：离体培养条件下一般为10004000lx（勒克斯），离体培养中通常难以达到4000lx，一般光量在20003000 lx。2光质：不同的光质对植物的光合作用、色素形成、向光性、形态建成的诱导等影响是不同。橙红光和蓝紫光是生理有效辐射，绿光很少被叶绿素吸收，属于生理无效辐射。据报道，芽分化的有效光谱成分为蓝紫光，波长为419540nm，波长为660nm的红光对芽分化无效。根分化则和芽分化相反，根分化受红光600680nm所刺激，而蓝光则无效。3光照时间：离体培养是否需要光周期，应根据植物种类、培养目的来决定。（1）愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗周期性光照、散射性光照。根据植物种类的不同做法不同：愈伤组织多数植物适合全暗或周期性光照，上述两种做法诱导频率差异不大。另一些植物差异较大，如石刁柏全暗诱导愈伤组织，要比周期性光照下好得多。大豆愈伤组织诱导采用散射光照比较好。（2）器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。光周期长短应植物种类而异。多数植物在810h光照，1416h黑暗为宜。（三）湿度组织培养中湿度的影响有两个方面，一是培养容器内的湿度条件，一是环境的湿度条件。容器内的湿度几乎是100%的相对湿度，二是环境的相对湿度一般要求7080%。周围环境的相对湿度低于60%时，培养基容易干涸，培养基的干涸会改变培养基的渗透压。由于渗透压的改变必然会影响到培养组织、细胞的脱分化、分裂和再分化。相反周围环境相对湿度过高，培养室潮湿，具备各种细菌和霉菌的滋生条件，它们的芽孢和孢子侵入培养瓶，造成培养基和培养材料的污染。（四）渗透压培养基的渗透压是由培养基中各种物质的总浓度决定的。培养细胞是通过细胞渗透来吸取营养的，当培养材料和培养基之间处于等渗时，或者培养材料的渗透压略低于培养基渗透压时，培养材料才可能从培养基中吸取养分和水分。1渗透压调节物质培养基各种物质中，糖对培养基渗透压起决定性作用。因此渗透压调节往往从调节糖浓度着手。，当然还可以用其他渗透压调节剂，如甘露醇、盐类等。2糖的种类和糖浓度，最多用蔗糖，也可以用葡萄糖和果糖。（1）不同种植物细胞脱分化和再分化所需糖浓度不同，多数植物种适宜的糖浓度为2%6%。（2）培养目的不同要求糖浓度不同：诱导器官脱分化形成愈伤组织为3%6%，愈伤组织芽分化为3%6%，根分化为2%3%。（3）培养方式不同对糖浓度要求不同棉花：器官培养3%蔗糖或葡萄糖。原生质体培养1%蔗糖、0.5%葡萄糖、11%甘露糖。（五）pH值植物组织和细胞在离体培养条件下，植物体内的酸碱度失去自行调节能力。因此在配制培养基时，应根据需要进行人工调节。植物细胞培养通常使用的pH值范围是5.56.5。pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。（六）通气条件无论是植物细胞培养还是动物细胞培养，容器空间中的O2及CO2用以保证细胞体内代谢活动的进行。通气是细胞液体深层培养重要的物理化学因子。好气培养系统的通气与混合及搅拌是相互关联的。对摇瓶试验，通常500mL的三角瓶内装80200mL的植物细胞培养液较适宜。当然，气液传质还与瓶塞的材料有关。试验表明，从溶氧速率考虑，以棉花塞最好，微孔硅橡胶塞次之，铝箔塞最差。二、营养条件培养基培养基：是离体培养的组织或者细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似于生物体内生存的营养环境，满足其正常生长和维持其完整结构及功能。（一）培养基的组成1. 无机盐1.1 无机大量元素：指在培养基中含量超过100mg/L的无机元素，包括N、P、K、Ca、Mg、S等。1.2 无机微量元素:指在培养基中含量低于100mg/L的无机元素。铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴等。2. 有机营养2.1 碳源蔗糖（具有热易变性，经高压灭菌后大部分分解为D-葡萄糖、D-果糖，只剩下部分蔗糖）或葡萄糖、果糖等。组织培养中蔗糖使用量为15，常用量2%3%。质量分数过低，不能满足细胞营养、代谢和生长的需要；质量分数过高，可能会干扰糖类物质的正常代谢，也可能会导致培养物渗透压的增加，阻碍细胞对水分的吸收，但在幼胚培养、茎间分生组织培养、花药培养和原生质体培养时，需要较高质量分数的糖，一般需要10左右或更高。蔗糖的作用有：为培养物提供能源和碳骨架；可以调节培养基的渗透压。2.2 氮源：氨基酸类、酰胺类。有机氮源对细胞初级培养早期阶段有利。2.3 活性物质：维生素类、肌醇、生物素等。维生素类：在植物细胞里主要以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。包括维生素B1、盐酸吡哆醇、烟酸、生物素，叶酸、维生素C等。肌醇：促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成；对组织细胞繁殖、分化的促进作用；使用浓度100 mg/L。2.4 生长调节物质一般分为生长素和分裂素，还包括赤霉素、乙烯和脱落酸。分裂素和生长素通常一起使用，来促使细胞分裂、生长，使用量在0.110mg/L之间，可根据不同细胞株而异。（1）生长素类：IAA、NAA、IBA等。在植物组织培养中，生长素主要用来刺激细胞分裂和诱导根的分化。常用的生长素有：吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。IAA活力较弱。NAA起动能力要比IAA高出3-4倍。IBA是促进发根能力较强的生长调节物质。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。2，4D起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成。（2）细胞分裂素类：（1）种类：6BA（6-苄氨基腺嘌呤 ）KT（激动素）ZT（玉米素）（2）作用：促进细胞分裂与扩大；诱导不定芽分化和茎、苗增殖；抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用其它类：赤霉素、脱落酸、乙烯。GA ( gibberellic acid)赤霉素。（1）种类：分别从植物,真菌和细菌中已经发现赤霉素类物质超过140种. GA3是目前主要的商品化和农用形式。（2）作用：促进幼苗茎伸长，促进不定胚发育成小植株；添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。2.5 复合物质复合物质通常作为细胞生长的调节剂，包括酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等。2.6 凝胶成分在固体培养中凝胶成分作为培养组织和器官的支撑物是不可缺少的。包括琼脂、琼脂糖、藻酸盐，新的凝胶成分：树胶、六磷酸肌醇胶等。2.7 活性炭活性炭在植物组织与细胞培养中的作用：活性炭可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。活性炭对于在茎尖初代培养时可吸附外植体产生的致死性褐化物（吸附酚类化合物时的适宜浓度是0.1-0.5%)；减弱光照促进生根；此外，在培养基中加入0.3%活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用，活性炭在胚胎培养中也有一定作用。（二）常用培养基的特点1. MS培养基特点：无机盐浓度高、元素间比例适当,离子平衡性好，具有较强的缓冲性，是目前使用最广泛的培养基。2. White培养基特点：机盐、有机成分含量较低，适用于生根培养。3. B5培养基 特点：含较高的NO3-N，氨态氮含量较低，含有较高的硫胺素（VB1）较适用于一些要求较高氮素营养的植物培养，如常见木本植物双子叶植物组培的选择。4. N6培养基特点：成分简单，KNO3 和 (NH4)2SO4含量高，适合花药培养,尤其适合禾本科植物的组织培养。第二节 培养基的配制一、母液的配置与保存培养基母液：配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取。一般母液配成比所需浓度高。常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类和激素类分别配制成比培养基浓度高10-100倍的母液，低温保藏。（1）大量元素母液配制无机盐中大量元素母液按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大10倍，用感量为0.01g的天平，分别用50mL烧杯称量，用蒸馏水溶解。（2）微量元素母液配制无机盐中微量元素母液，按培养基配方用量的100倍，用感量为0.0001g电子天平，分别用50mL烧杯称量，用蒸馏水溶解。（3）铁盐母液的配制目前常用的铁盐是一种比较稳定的螯合铁，它是硫酸亚铁合乙二胺四乙酸二钠的螯合物。（4）植物激素和其他母液配制激素类、维生素类以及用量较小的有机物类，为了使用方便和准确，也应配制成母液。母液浓度应根据配方的需要量灵活确定，经常应用