实验四植物组织中核酸的提取和测定.doc

实验四 植物组织中核酸的提取和测定一、 实验目的1.掌握从植物组织中提取核酸的方法。2.掌握RNA、DNA 的定性鉴定方法。二、实验原理用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯乙酸溶液在低温下抽提植物组织匀浆，以除去酸溶性小分子物质，再用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液(10氯化钠溶液)和0.5molL 高氯酸(70)分别提取DNA 和RNA，再进行定性鉴定。由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用此法来定性、定量测定核酸。1.核糖的测定测定核糖的常用方法是苔黑酚(即3，5二羟甲苯法(Orcinol 反应)。当含有核糖的RNA 与浓盐酸及3，5二羟甲苯在沸水浴中加热1020分钟后，有绿色物产生，这是因为RNA 脱嘌呤后的核糖与酸作用后生成糠醛，后者再与3，5二羟甲苯作用产生绿色物质。2.氧核糖的测定测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的DNA 和二苯胺在沸水浴中共沸10分钟后，产生蓝色。这是因为DNA 嘌呤核苷酸上的脱氧核糖与酸生成羟基6酮基戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。上述两种定糖的方法准确性较差，但快速、简便，能鉴别DNA 与RNA，是鉴定核酸、核苷酸的常用方法。三、仪器、原料与试剂仪器：恒温水浴锅、离心机、吸管、量筒、电炉、布氏漏斗装置、 烧杯、剪刀。原料：新鲜菜花(花椰菜)试剂：1. 95乙醇：600mL2. 丙酮：400mL3. 5高氯酸溶液：200 mL4. 0.5mol/L 高氯酸溶液：200mL5. 10氯化钠溶液：400mL6. 标准RNA 溶液(5mg/100mL)：50mL7. 标准DNA 溶液(15mg/100mL)：50mL8. 粗氯化钠：250g9. 海砂：5g10. 二苯胺试剂60mL将1g 二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中，再加入2.75 mL 浓硫酸(置冰箱中可保存6个月。使用前，在室温下摇匀)。11. 三氯化铁浓盐酸溶液：25mL将2 mL10三氯化铁溶液(用FeCl36H2O 配制)加入到400 mL 浓盐酸中。12. 苔黑酚乙醇溶液：200mL溶解6g 苔黑酚于100 mL95乙醇中(可在冰箱中保存1个月)四、操作步骤(一)核酸的分离1.取菜花的花冠20g，剪碎后置于研钵中，加入20mL95乙醇和400mg 海砂，研磨成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。2.滤渣中加入20mL 丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。3.再向滤渣中加入20mL 丙酮，搅拌5分钟后抽干(用力压滤渣，尽量除去丙酮)。4.在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的20mL5高氯酸溶液中。搅拌，抽滤，弃去滤液。5.将滤渣悬浮于20mL 丙酮，搅拌5分钟后抽干(用力压滤渣，尽量除去丙酮)。6.滤渣中加入20mL 丙酮，搅拌5分钟，抽滤渣，用力压滤渣尽量除去丙酮。7.将干燥的滤渣重新悬浮在40mL10氯化钠溶液中。在沸水浴中加热15分钟。放置，冷却，抽滤至干，留滤液。并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并，为提取物一。8.将滤渣重新悬浮在20mL0.5 mol/L 高氯酸溶液中，加热到70、保温20分钟(恒温水浴)后抽滤，留滤液(提取物二)。(二)RNA、DNA 的定性鉴定1.二苯胺反应按下表加入各反应