中国南海软体动物及其食源生物的化学化学生态学和生物活性研究.docx

中国南海软体动物及其食源生物的化学化学生态学和生物活性研究中国南海软体动物及其食源生物的化学化学生态学和生物活性研究 海洋生物资源是论文联盟一个巨大的、潜在的未来新药来源的宝库，对海洋药物的研究与开发已成为过去45年来各国天然产物研究及医药产业重点关注的领域。从海洋无脊椎动物及海藻中寻找天然小分子生物活性物质是近年来国际上的一个热点，目前已经发现了2万余种的具有新型化学结构和多方面生物活性的单体化合物，其中14种化合物正在进行临床研究，另有3个新药上市。 我国虽然为海洋大国，海洋生物资源相当丰富，但是在海洋天然产物应用基础研究以及海洋药物的研究与开发方面却与发达国家的差距非常显著。究其原因，主要是我国在海洋药物先导化合物发现方面的基础研究力量薄弱，从事相关研究、尤其是从事海洋天然产物发现和研究的科研机构相对偏少、人才匮乏，药物发现的活性评价模型不够全面、科学，未能提供足够的新型结构化合物用于生物活性和新药研发筛选，致使新药先导化合物发现的几率偏低。因此，建立合理、科学的药物发现和评价模型，加强对我国海洋动、植物化学成分的研究，从中发现、鉴别得到大量的海洋天然产物以供新药研发筛选是我国产生具有自主知识产权的海洋药物的关键。 海洋软体动物主要生活于海底，以海绵、海藻、水螅虫、苔藓虫、海葵和珊瑚为食，可以是肉食性的、也可以是草食性的，生命周期及生长特性与生活习性密切相关，寿命的长短取决于其食物寿命的长短。这些软体动物色彩艳丽、行动缓慢，主要依赖次生代谢产物形成的化学防御机制对抗天敌的捕食以求得生存。这种由生物进化形成的化学防御策略为我们从自然界寻找某种具有生物活性的化合物提供了一条简洁、有效的途径。在此基础上再进行高通量活性筛选无疑将更容易发现新的活性天然产物，大大提高新药先导化合物的发现几率。 软体动物个体较小，且多生长在深海，导致样品采集非常不易，这给对其化学成分的研究以及随后的生物活性筛选带来极大的困难和挑战。这一矛盾可以通过研究软体动物的食源生物得到解决：研究发现，很多软体动物的次生代谢产物同样可以从其食源生物中获得。这是因为除少数软体动物能够生物合成自身所需要的化学物质而建立其化学防御体系外，多数软体动物是通过选择适当的食物并将其中有用的代谢物质经过进一步的生物转化或直接积累到身体的特定部位以保护自己不受天敌捕食的。这样，对软体动物的食源生物的研究不但可以从化学角度确证它们的生态学关系（捕食-被捕食）、拓展其次生代谢产物的生物多样性，而且可以补充由于软体动物难以采集造成的因化合物得量太少所致对随后生物活性研究的制约。 对海洋软体动物及其食源生物的化学成分的研究不但有利于发现新药先导化合物，而且可以从化学角度阐明其食物链上的生态关系。因此，这一研究领域越来越得到世界海洋天然产物界的重视，成为近年来海洋天然产物研究的热点。意大利的Cimino教授是国际同行公认的海洋软体动物研究权威，他近年来发表的一系列综述总结了其研究小组在此研究领域所作出的贡献。 我国海洋中蕴藏着丰富的海洋软体动物资源。据不完全统计，我国海洋中生活着2 500余种软体动物。由于海洋软体动物标本的采集极为困难，加上生物样本不易富集，致使研究者们经常只能在极少样本量（有时只有1个个体）的情况下对样本进行化学成分的研究，这就要求研究人员必须具有较高的分离和结构解析技能，同时也对配套的仪器性能和分析方法提出了较高要求。基于上述在海洋软体动物研究方面存在的诸多困难，我国虽然在海洋天然产物研究方面已有20多年历史，但对软体动物的研究报道却非常少。我们希望通过对我国南海软体动物及其食源生物的深入研究获得大量有关我国软体动物的资源分布、生物学、生态学、化学及药理等方面的信息和知识。同时，通过课题的开展，还可以开辟一个提供新型结构海洋天然产物的重要来源，大大提高新药先导化合物的发现几率，并从中筛选出一批化学结构新型、生物活性显著的海洋新药先导化合物，提高我国新药研发的自主创新能力和知识产权的保护能力。 1研究与结果 东南沿海是我国海洋生物种类最丰富的海域，我们经过多次采集得到了30余种海洋软体动物及其70余种食源生物（海绵、珊瑚各30余种，海藻10余种）。通过现代分子药理学（靶受体、靶基因）、高通量筛选技术、药效学、毒理学、海洋生态和分类学、海洋天然有机化学等多学科的密切配合和综合应用，对其中40种海洋生物的活性成分进行了系统研究，考察食物链关系；同时，对得到的化学成分进行抗肿瘤、抗艾滋病毒、降血糖、抗菌和抗真菌活性评价，并对具有显著生物活性的化合物的药理及构效关系进行了系统研究，为进一步发现新药先导化合物打下了实验基础。 1.1软体动物及其食源生物的化学成分研究和生态食物链关系考察 1.1.1软体生物的化学及化学生态学研究 软体生物与其食源生物之间的生态学关系是国际上海洋天然产物研究的前沿和热点。但因其研究难度大（个体小、生物量少、采集难、化学成分研究更难），国内相关研究基本上是空白，国际上也只有欧美少数几个国家在从事相关研究。我们在国内率先开展了这方面的研究，先后完成了15种软体动物的化学及化学生态学研究。这15种软体动物包括后鳃亚纲裸鳃目海神鳃科（Glaucidae）软体动物Phyllodesmium magnum和Phidiana militaris，车轮海牛科（Actinocyclidae）软体动物日本车轮海牛（Actinocyclus papillatus），杜五海牛科（Tritoniidae）软体动物Tritoniopsis elegans，六鳃科（Hexabranchidae）软体动物血红六腮（Hexabranchus sanguinus），片鳃科（Arminidae）软体动物美丽拟皮片鳃（Dermatobranchus ornatus），舌尾海牛科（Glossodorididae）3种软体动物双色玻缘海牛（Glossodoris cincta）、地母多彩海牛（Chromodoris geometrica）和Chromodoris reticulate，刺海牛科（Kentrodorididae）软体动物烟囱壶形海牛（Jorunna Funerbris），叶海牛科（Phyllididae）2种软体动物丘凹叶海牛（Phyllidia pustulosa）及未定名叶海牛（Phyllidia sp.），肺螺亚纲石璜科（Onchidiidae）软体动物瘤背石璜（Onchidium verruculatum），前腮亚纲腹足目海兔螺科（Ovulidae）软体动物海兔螺（Ovula ovum）以及鲍科软体动物耳鲍（Halotis asinine）。我们从中发现了一系列的生物活性物质，如二聚四氢异喹啉生物碱（图1中的化合物1）以及新骨架吲哚生物碱菲地鳃甲素（图1中的化合物2）和菲地鳃乙素（图1中的化合物3）等，其中化合物1正是ectEinascidin系列化合物中ecteinascidin-637（ET637）的去乙酰化物，而菲地鳃甲素和菲地鳃乙素为首次从自然界中分离得到的具有1, 2, 4-oxadiazole结构片段的化合物，对多种肿瘤细胞生长显示有强烈的抑制活性（表1），为新药先导化合物的发现提供了物质基础。通过对上述软体动物的捕食生物进行化学成分研究或与文献中相关生物化学成分进行比对，我们发现美丽拟皮片鳃和软体动物P. Magnum与柳珊瑚，血红六腮、Glossodoris属和Phyllidia属软体动物与海绵以及Halotis属软体动物与Cladophora属绿藻间可能存在捕食与被捕食的生态学关系，部分实验结果仍在整理之中。 思想汇报 上述软体动物多为后鳃亚纲软体动物，这是因为该种群动物基本失去了物理外壳的保护，它们的化学防御体系更加重要和完善，具有可有效地将活性物质积累到身体中容易受到攻击的部位以抵御天敌捕食的特点，使我们更容易通过化学成分的研究获得具有强力生物活性的化合物，为新药先导化合物的发现提供物质基础。 1.1.2海绵的化学及化学生态学研究 海绵是肉食性软体动物的重要食源生物，也是新药先导化合物的重要来源。我们先后对10种海绵及两株海绵内生菌的化学成分进行了系统研究，它们分别是4种Dysidea属海绵10-15、2种Axinyssa属海绵16-19、蜂海绵Haliclona sp.、海绵Acanthella sp.、海绵Hyrtios erectus和海绵Neopetrosia exigua以及海绵内生菌Streptomyces sp.和Bacillus vallismortis，获得了倍半萜、倍半萜二倍体、二萜、二倍半萜、噻唑生物碱、大环二胺生物碱和二酮哌嗪等许多结构新型的活性化合物，并探讨了这些化合物的可能的生物防御作用及生物来源，证实了Dysidea属海绵与丘凸叶海牛属和Doriopsilla属软体动物间12,19以及海绵Acanthella与Hexabranchus属和Phyllidiella软体动物间存在着捕食与被捕食的化学生态学关系。体外活性筛选结果显示，这些化合物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤和降血糖等多种生物活性，其中来自海绵Dysidea villosa的dysidine（图2中的化合物4）和来自海绵Hyrtios erectus的hyrtiosal（图2中的化合物5）分别显示具有良好的蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制活性及抗艾滋病毒活性，IC50分别为1.50和9.60 µM，具有进一步研究的价值。 思想汇报 1.1.3珊瑚的化学及化学生态学研究 珊瑚是肉食性软体动物的另一类重要食源生物，全球约有7 000多种，主要分为八放珊瑚和六放珊瑚两个亚纲。化学成分研究集中在八方珊瑚、包括软珊瑚和柳珊瑚上，萜类和甾醇化合物是它们的特征性化学成分。 我们对采自中国南海的10种软珊瑚和3种柳珊瑚的化学物质进行了系统研究。软珊瑚包括3种短指软珊瑚（Sinularia sp., S. depressa, S. parv）25-27、3种肉芝软珊瑚（Sarcophyton glaucum, S. latum, S. tortuosum）28-31、2种豆荚软珊瑚(Lobophytum sp., L. Crassum)32-34、多棘软珊瑚（Spongodes sp.）35-37和软珊瑚Scleronephthya sp.；柳珊瑚包括中华小尖柳珊瑚Muricella sinensis、小月柳珊瑚Menella sp.和弯曲小尖柳珊瑚Muricella flexuosa40,41。化学物质的类型主要涉及倍半萜、二萜、二萜二聚体和甾体等。软珊瑚中富含cembrane型二萜，其二聚体是肉芝软珊瑚的典型次生代谢产物。这类大环化合物的绝对构型的鉴定是天然产物结构鉴定的难点之一，我们首次将固体圆二色谱/含时密度泛函方法应用到此类化合物的结构鉴定中并取得了良好效果。从多棘软珊瑚中得到的新甾体化合物多棘酸酯（图2中的化合物6，methyl spongoate）对人肝癌细胞BEL-7402显示有较强的抑制活性，IC50为0.14 µg/ml，具有进一步研究的价值。从中华小尖柳珊瑚中分离得到的二萜化合物与软体动物美丽拟皮片腮中得到的化合物结构相似，但含量不到后者的1/20，故推测中华小尖柳珊瑚可能是美丽拟皮片腮的食源动物，且美丽拟皮片腮具有极强的从食物中选择并富集次生代谢产物并将这些化学物质转移到身体的特定部位以形成自身化学防御体系的能力。 思想汇报 1.1.4海藻的化学成分研究 海藻是许多素食性软体动物的食源生物。我们从我国东海海域采集到了红藻冈村凹顶藻（Laurencia okamurai）和绿藻杉叶厥藻（Caulerpa taxifolia）。从红藻冈村凹顶藻中分离得到20余种laurane型倍半萜及其结构重排物，这些化合物在抗真菌以及环氧化酶-2和PTP1B抑制活性测试中均显示阴性结果。但它们在结构上与Aplysia属海兔中分离鉴定出的倍半萜类化合物相似，提示Aplysia属海兔与Laurencia属红藻间可能存在捕食-被捕食的化学生态学关系。从绿藻杉叶厥藻中也分离并鉴定出了11种化合物、包括芳香化valerenane型倍半萜类化合物和吲哚生物碱caulerpin，其中caulerpin具有显著的PTP1B抑制活性，IC50为3.77 µM。 1.2活性化合物的活性评价、合成及构效关系研究 对在前期活性测试中分别显示具有PTP1B抑制活性、抗艾滋病毒和抗肿瘤活性的3个不同类型化合物dysidine、hyrtiosal和多棘酸酯进行活性的重新评价及合成研究，以初步探讨它们可能的作用机制，为新药先导化合物的发现提供实验依据。 利用分子水平的PTP1B抑制剂筛选技术发现，dysidine能够显著抑制PTP1B的活性（IC50为1.5 µM），且其主要选择性地作用于PTP1B，对PTP家族其它成员的影响则较小。在细胞水平上，dysidine能够显著激活胰岛素信号通路中的2个关键因子I受体和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）的磷酸化，对胰岛素通路的下游效应因子糖原合酶激酶-3和细胞外调节蛋白激酶同样也有激活作用。dysidine还可显著增加3T3-L1细胞吸收葡萄糖的能力，20 µM浓度的激动能力与胰岛素相当。 思想汇报 抗艾滋病毒系统研究显示，hyrtiosal能够竞争性地抑制艾滋病毒整合酶与艾滋病毒的结合。使用表面等离子共振技术进行活性测试证实，hyrtiosal作用于