细菌的染色技术及微生物大小的测定-实验四.doc

实验四细菌的染色技术及微生物大小的测定标准实验报告适用专业： 环境工程江苏科技大学生物与化工学院环境工程系2012年 8 月第一部分 微生物的染色技术第二部分 微生物大小的测定一、实验目的1. 加深对微生物的染色原理的理解、熟悉并掌握染色的基本操作技术，重点掌握微生物的革兰氏染色法；2熟悉目测微尺和物测微尺的使用方法，掌握测定微生物大小的技能。3巩固光学显微镜的使用方法二、实验要求1预习有关细胞染色等方面的知识；2遵守实验室安全制度，听从指导教师安排；3认真听讲，不懂就问；4完成实验报告三、实验仪器和材料（一）细菌的染色1仪器：光学显微镜、载玻片、接种环、酒精灯（或煤气灯）、培养皿、擦净纸、标签纸、吸水纸2材料：无菌水、二甲苯、香柏油（或液体石蜡）、草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液、石炭酸复红（品红）染液3菌种：上次学生实验培养的细菌斜面种、E.coli（二）微生物大小的测定：目测微尺、物测微尺、光学显微镜、微生物标本片四、实验原理及方法（一）微生物的染色1.染色原理：微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的，在显微镜下，由于光源是自然光，使微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构，若增加其反差，微生物的形态就可看得清楚。通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。经测定，细菌等电点在pH=2-5之间，故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH7）或偏酸性（pH=6-7）的溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的为多。碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红，孔雀绿和蕃红等。微生物体内部结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。2. 染色方法：复染色法：指用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。抗酸性染色法多在医学上采用。革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法。它可将细菌区别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。它的染色步骤为：先用草酸铵结晶紫染色，经碘碘化钾（媒染剂）处理后用乙醇脱色，最后用蕃红液复染。如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被乙醇脱色，用蕃红液复染后仍呈紫色者叫革兰氏阳性菌，被乙醇脱色用蕃红液复染后呈红色者为革兰氏阴性菌。（二）细胞的大小测定1. 目测微尺：目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。2. 物测微尺 中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将1mm等分成100格，每格长0.01mm（即10m）。它并不直接测细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。五、实验步骤及内容（一）细菌的染色1制片（1）涂片：取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作个记号并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种（大肠杆菌或枯草杆菌）与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。（注：活性污泥染色是用滴管取一滴活性污泥于载玻片上铺成一薄层即可。）（2）干燥：最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干。但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。（3）固定：将已干燥的涂片正面向上，在微小的火焰上通过23次，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上。2用草酸铵结晶紫染液染1min，水洗。3加革氏碘液媒染1min，水洗。4斜置载玻片于一烧杯之上，滴加95乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色即可，随即水洗。（注：为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置30s至45s，水洗。）5用蕃红染液复染1min，水洗。6用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。（二）微生物大小的测定1目测微尺的标定将目测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；把物测微尺放在载物台上使刻度朝上。用低倍镜找到物测微尺的刻度，移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。再分别求出高倍镜和油镜下目测微尺每格的长度。2菌体大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物的大小，分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数，再按目测微尺1格的长度算出菌体的长度和宽度。六、实验结果（一）细菌的染色大肠杆菌为G-，染色后为红色，金黄色葡萄球菌（或枯草芽孢杆菌）为G+，染色后为紫色。（二）微生物大小的测定：例：细菌大小：标数：31 大肠杆菌大小：实际：1.82um0.91um 标定目镜物镜数据结果（注：参考数据：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)球型，直径0.8 um左右；大肠杆菌大小0.4 0.71 3um；枯草芽孢杆菌单个细胞0.70.823um;）七、实验过程中应注意事项及心得1. 染色关键是必须要严格掌握乙醇脱色程度，脱色的时间一定要控制在30S-45S，如果脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。2. 涂片时，挑取的菌种不能太多，否则涂片上的菌种容易行程多层细胞，不易染色脱色，影响实验结果八、思考题1微生物的染色原理是什么?答：微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的，在显微镜下，由于光源是自然光，使微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构，若增加其反差，微生物的形态就可看得清楚。通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。经测定，细菌等电点在pH=2-5之间，故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH7）或偏酸性（pH=6-7）的溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的为多。碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红，孔雀绿和蕃红等。 微生物体内部结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。 2你用革兰氏染色法染大肠杆菌和枯草杆菌后各得什么结果（包括颜色、细菌形态、为何种染色反应等）?答：大肠杆菌为革兰氏阴性菌、红色，杆状；枯