开题报告-姜姜3-sp.doc

毕业设计(论文)开题报告学生姓名： 姜维艳 学 号： 1302110204 所在学院： 生物与制药工程学院 专 业： 生物工程 设计(论文)题目： Glarea lozoyensis的的胞内代谢物样品制备的研究指导教师: 黄 和 教授 徐 娴 助教 2015年 1 月 10日毕 业 设 计（论 文）开 题 报 告1结合毕业设计（论文）课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写2000字左右的文献综述： 文 献 综 述1. 纽莫康定简介 1.1棘白菌素类抗生素棘白菌素,又称棘球白素,是一类新型抗真菌药,属于乙酰六环类,为葡聚糖合成酶抑制剂,非竞争性地抑制真菌细胞壁的-(1,3)-D-葡聚糖的合成而发挥杀菌作用1。葡聚糖是一种真菌细胞壁多糖,是细胞壁的重要成分,它能使细胞壁保持完整性并使其渗透压保持稳定。而哺乳动物细胞无细胞壁,故对细菌无效。因此这类药物可以有效的用于杀灭对氮唑类和两性霉素B 产生抗性的真菌。没有溶血毒性以及较少的药物相互作用也使得这类药物比传统的抗真菌药物具有更大的优势。明显不同于传统的抗真菌药物的作用机制。本类药物对人体的毒性低,从1988年开始试验,目前进入临床研究的有三种:卡波芬净,米卡芬净,安多芬净。 现已发现多种棘白菌素类药物，按结构特征大致可分为三类：echinocandin 类、pneumocandin 类和含硫脂肽类。1.2 纽莫康定B0抗真菌药物卡泊芬净的前体纽莫康定( Pneumocandin ) 类棘白菌素化合物是Merck公司科学家发现并命名的， 生产菌为Glarea lozoyensis2，是由从西班牙马德里的洛索亚流域附近的水塘中分离出来的一株丝状真菌3，产的纽莫康定是一类由六肽和脂肪酸构成的酯肽4,5，主要有A0 和B0 两种有效产物。通过对药效较好的B0修饰，得到一种水溶性半合成衍生物泊芬净( Caspofungin )，商品名为赛克斯( Cancidas )，于2001年获FDA批准是第一个上市的棘球白素类药物。卡泊芬净目前已在70多个国家被广泛使用，对耐氟康唑的念珠菌、曲霉菌、孢子菌均有较强的活性。目前，该产品已成为全身用抗真菌药市场的王牌药物。图1 纽莫康定B0和科赛斯的结构2. 微生物代谢组学的研究方法与进展2.1代谢组学的介绍 代谢组学是对生物系统中的相对低分子量代谢物进行全面、定性和定量的分析，考察生物体系受到刺激或扰动（如某一特定的基因变异或环境变化）后，其代谢产物的变化或其随时间的变化来研究生物体系的一门科学6。代谢物处于生物系统生化活动的末端，基因和蛋白质表达的微小变化会在代谢物上得到放大。而且科学家们逐渐认识到：基因组的变化不一定能够得到表达，从而并不对系统产生实质影响。某些蛋白质的浓度会由于外部条件的变化而升高，但由于这个蛋白质可能不具备活性，从而也不对系统产生影响。同时，由于基因或蛋白质的功能补偿作用，某个基因或蛋白质的缺失会由于其他基因或蛋白质的存在而得到补偿，最后反应的净结果为零8。而小分子的生产和代谢才是这一系列事件的最终结果，它能够更准确地反映生物体系的状态。因此代谢物是机体表型最好的指示剂7，其包含着反映生理表型的直接而全面的生物标记物信息。2.2微生物代谢组学的研究技术方法微生物培养快速取样 淬灭代谢物的提取 一维或二维分（LC,GC,CE)检测MS,NMR,IR数据处理生物学解释 图2（上图） 微生物代谢组学研究流程2.2.1微生物的培养 培养基为微生物的生长及其代谢产物的形成提供必需的营养物质和能量，是影响发酵水平的重要因素之一。代谢组学因为是分析胞内产物，复杂的培养基成分会给胞内产物的分析带来干扰，虽然通过清洗细胞可以去除部分培养基，但是胞内代谢物的水平是微量，残余的培养基成分仍然会给分析带来误差，所以代谢组学的培养基一般要求成分确定的合成培养基。次级代谢产物由于代谢途径复杂，通常需要在营养成分丰富的天然培养基中生产，所以在建立纽莫康定B0高水平发酵过程之前，需要对培养基进行优化，以获得纽莫康定B0高产的合成培养基。 单因素法仍然是目前实验室最常用的试验方法，是逐个考察因素的优化方法。当需要考察的因素较多的时候，这种方法就需要繁多的实验组数和较长的实验周期，而且还可能因为实验批次的不同和实验条件的不统一，从而导致不可靠甚至错误的结果，尤其是对具有交互影响的多因素实验。然而因为操作简单、结果也能直观地用图表表示，因此单次单因子实验对实验设计是很重要的9-10。 正交试验设计应用的非常广泛，它相比于同因素同水平的单因素实验，正交试验次数明显要少，并且可以通过方差分析，得到影响实验结论的主次因素以及考虑因素之间的交互影响11。但是当考虑因素间的交互作用时，正交试验明显存在不足。同时正交试验在最终选取最优实验方案时，一般需要通过经验来去除不显著因素，这不适合于创新性的实验。2.2.2快速取样与代谢淬灭 由于一些代谢物在微生物体内的转换时间非常短暂，通常在 1-2s，其生理状态的变化会更加迅速，分析时样品的代谢组成分必须保证与取样时一致，才能反映样品当时的代谢活动，因此这一反映特定生理状态的代谢状态必须要被“固定”住，直到分析完成。这要求方法学上的有效性，以确保分析的结果确实反映真菌刚被取样时的状态，避免发生生物和非生物学改变导致部分代谢物外流或污染外来化合物分子。理想的淬灭方法应符合以下原则：立即捕获（冻结）细胞的代谢活动；在淬灭过程中细胞膜没有显著的损害发生，因为这可能导致胞内代谢物泄漏；代谢产物在整个过程中不应被物理或者化学修饰，从而使他们无法辨认或检测34。冷甲醇淬灭是目前使用最广泛的淬灭剂，因为其不但可以在亚秒的时间范围内阻断代谢反应15，而且还可以将胞内外的代谢物区分开16-17。例如黑曲霉的取样方是将发酵液样品直接转移至60%（v/v）加入缓冲剂的甲醇/水溶液中快速淬灭代谢反应，温度条件为-45 18，然后离心，分离淬灭剂与发酵液的混合液。液氮冷冻或高氯酸灭活技术是植物和动物代谢组学研究中主要使用的灭活方法12，这种方法无法将胞外和胞内的代谢物分开13。但是丝状真菌细胞壁较厚，液氮碾磨可以去除部分细胞壁。比如红曲霉（Monascus ruber），一种淬灭方法是将菌丝发酵液直接投入液氮中进行快速淬灭，这种方式与甲醇淬灭的效果相似14，经液氮处理后的菌体以低温干燥以去除发酵液中的水分。目前，还有另一种方式是采用膜过滤器（孔径0.45-m）对发酵液进行快速真空过滤、洗涤，随后再对菌丝体进行淬灭，将菌丝体转移至-30 的冷甲醇/水溶液中19。 此外，Faijes 等20以植物乳杆菌为研究对象，以冷甲醇淬灭为标准方法，对比了分别在其中添加 HEPES、NaCl 和碳酸铵这三种缓冲剂对淬灭效果的影响，结果显示添加了 70mM HEPE和 0.85% (W/V) 碳酸铵可以显著减少胞内代谢物的泄露，因为其可以维持菌体内渗透压，防止冰晶的产生。但是 Canelas 等21的研究表明，添加缓冲剂没有显著的意义，相反还会增加大多数小分子代谢物的泄露程度。Jinran等22在研究乳酸乳球菌的胞内代谢产物时发现冷甲醇淬灭导致了其胞内代谢产物出现大量的漏出Villas-Bas 等23为了解决细胞泄露的问题，采用 60%冷甘油-盐水淬灭酵母和细菌，并认为此法是淬灭酵母和细菌最好的方法，可以很好的解决细胞泄露。但 Spuraet 等24验证了这种冷甘油-盐水的淬灭方法，发现高浓度的甘油不符合淬灭的原则，因为60%甘油非常的粘稠。 2.2.3胞内代谢物的提取 灭活细胞之后，要将胞内代谢物萃取出来。完美的代谢物提取的要求是：能够最大限度的提取代谢物；无偏向性，不排除具有特殊物理、化学性质的分子；不会破坏或改变代谢物的物理或化学特性。 目前，使用较多的胞内代谢物的提取方法有高氯酸或碱、甲醇-氯仿法、热甲醇、和冷甲醇法等。高氯酸提取法在细菌代谢物的提取应用较为广泛，该方法较适合水溶性代谢物和核苷酸类物质的提取，酸、碱提取法通常用于提取微生物胞内在酸、碱条件下比较稳定的代谢物25，该方法较易实现自动化；甲醇-氯仿法操作繁琐，且氯仿有毒性，重要的是非极性的代谢物采用该方法提取效果较好 26-27；热甲醇提取法不适合热敏性代谢物的提取28；冷甲醇法具有简单、快速、提取溶剂易于去除、无盐加入、代谢物易于浓缩及 pH 值变化较小等优点而被广泛应用29。由于微生物种类复杂，目前，还没有建立通用的微生物胞内代谢物的提取方法。 2.2.4代谢物的分析平台GC-MS法是微生物代谢组学平台中应用较早和使用较为频繁的方法， GC-MS 分离性能好，且易于操作和较为经济。Nielsen 等31将 GC-MS 应用于微生物代谢组学中：他们对样品进行衍生化后采用建立了有机酸和氨基酸的 GC-MS 技术平台。Koek 等32也创立了基于气质联用分析平台，并通过实验证明了该平台对大肠杆菌的适用性。代谢组学研究中分析方法比较见表1-3。表 1-3 代谢组学研究中分析方法比较33方法 优点缺点核磁共振 NMR无偏向性。具有无损伤性，不破坏样品的结构和性质，需要样本少，可进行实时和动态的检测。灵敏度低（10-6），分辨率不高。气质联用 (GC-MS) 分辨率、灵敏度（10-12）和重复性高；有用于定性分析的标准图谱，和自动质谱峰识别和鉴定系统。 样品需要干燥；难挥发性组分需要衍生，可能引起样品变化；无法分析热不稳定性和大分子的物质。液质联用(LC-MS) 灵敏度（10-15）和选择性较高，对于强极性、低挥发度、高分子量和热不稳定代谢物的分析有较好的优势。样品需要浓缩（真空干燥），样品分析时间较长，无定性标准谱库，存在离子抑制现象。 毛细管电泳质谱联用(CE-MS) 样品不需要特殊处理、用量少、试剂成本低、分析速度快、灵敏度高（10-23）、高通量以及测试时间短等特点30对于易于离子化的强极性代谢物， 有较好的分析效果。需要较高的样品浓度。方法复杂，还需进一步发展。傅立叶变换红外光谱与质谱联用 (FTIR-MS) 扫面速度快，光通量大，高分辨率。不能进行定量分析。 3. 代谢组学在微生物领域的研究进展 到目前为止，微生物代谢组学已广泛应用于微生物的各种领域，如微生物鉴定，突变体的筛选和基因功能研究，代谢途径的鉴定和微生物工程。比较植物和动物，微生物研究的主要缺点是其代谢产物一般都很复杂，很难确定。此外，微生物的代谢产物不易分离。但在全系统的框架，研究微生物系统在高等生物中具有明显的优势。微生物是不太复杂的生物有机体，大多数微生物的基因组序列数据，都是现成的。关于基因调控，代谢网络，和微生物细胞的生理信息也是很容易理解的。因此，微生物这个研究领域，很大得益于代谢组学的发展。4.本研究的主要内容及意义4.1本研究的主要内容1)通过文献检索，查阅有关纽莫康定B0发酵、微生物代谢组学中合成培养基优化和胞内代谢物样品制备的相关进展； 2)通过单因素及正交试验考察不同碳源、氮源、无机盐配比，考察合成培养基各组分的最佳配比；3）使用不同的淬灭方法，对比代谢物的提取效果及对细胞的影响。4.2本研究的主要意义迄今为止，未有关于丝状真菌G. lozoyensis的代谢组学研究方法，代谢组学的首要重点是尽可能多地测定取样时代谢物的相对浓度，而且不同代谢产物提取方式方法对于不同微生物的可靠性甚至存在矛盾基。所以本课题以G. lozoyensis为研究对象，在纽莫康定B0高产合成培养基的基础上，考察不同样品制备方法对胞内代谢物的提取效果的影响，为G. lozoyensis的代谢组学研究奠定基础，也可以为其他丝状真菌提供一个有价值的参考。参考文献：1. Denning, D.W., Echinocandin antifungal drugs. Lancet, 2003. 362(9390): 1142-51.2. Schwartz, R.E., et apneumocandins.form.zalerion-arboricoia.1.discovery.and.isolation. Journal of Antibiotics, 1992. 45(12): 1853-1866.3. Schwartz, R.E., et al., L-671,329, a new antifungal agent. I. Fermentation and isolation. J.Antibiot (Tokyo), 1989. 42(2): 163-7.4. Mizuno, K., et al., Studies on aculeacin. I. Isolation and characterization of aculeacin A. J Antibiot (Tokyo), 1977. 30(4): 297-302.5. Wichmann, C.F., J.M. Liesch, and R.E. Schwartz. L-671,329, a new antifungal agent. II. Structure determination. J Antibiot (Tokyo), 1989. 42(2): 168-73.6. Roux A, Lison D, Junot C, et al. Applications of liquid chromatography coupled to mas mass spectrometry-based metabolomics in clinical chemistry and toxicology: A review J. Clinical biochemistry, 2011, 44(1): 119-35.7. Blow N. Metabolomics: Biochemistrys new look J. Nature, 2008, 455(7213): 697-700.8. Ellis D I, Goodacre R. Metabolomics-assisted synthetic biology J. Curr Opin Biotec Biotechnol,2012, 23(1): 22-8.9. Czitrom V. One-factor-at-a-time versus designed experimentsJ. The American Statistician,1999,53(2): 126-131.10. Box G E P,Wilson K B. On the experimental attainment of optimum conditionsJ. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), 1951,13(1): 1-45.11. 李春喜,志和J.王文林.生物统计学(第二版),2004.325-34612. Bundy JG, Spurgeon DJ, Svendsen C, et al. Earthworm species of the genus Eisenia can be phenotypically differentiated by metabolic profiling. FEBS Let 2002, 521: 115-120. 13. Villas-Boas SG, Mas S, Akesson M, et al. Mass spectrometry in metabolome analysis. Mass Spectrom Rev. 2005, 24: 613-646. 14. Hajjaj H, Blanc P J, Goma G, et al. Sampling techniques and comparative extractio procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi J. FEMS Microbiology Letters, 1998, 164195-200.15. Bolten C J, Wittmann C. Appropriate sampling for intracellular amino acid analysis in five phylogenetically different yeastsJ. Biotechnology letters, 2008, 30(11): 1993-2000. 16. Winder C L, Dunn W B, Schuler S, et al. Global metabolic profiling of Escherichia coli cultures: an evaluation of methods for quenching and extraction of intracellular metabolitesJ. Analytical Chemistry, 2008, 80(8): 2939-2948. 17. Jana S,Lorenz CR, Patricia W, et al. A method for enzyme quenching in microbialmetabolome analysis successfully applied to gram-positive and gram-negative bacteria and yeast J. Analytical Biochemistry. 2009, 394(2):192201. 18. Ruijter G J G, Visser J. Determination of intermediary metabolites in Aspergihs J. Journal of Microbiological Methods 1996, 25295-302.19. Smart K F, Aggio R B M, Van Houtte J R, et al. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry J. Nature protocols, 2010, 5(10): 1709-29.20. Faijes M, Mars A E, Smid E J. Comparison of quenching and extraction methodologies for metabolome analysis of Lactobacillus plantarumJ. Microbial cell factories, 2007, 6(1): 27. 21. Canelas A B, Ras C, ten Pierick A, et al. Leakage-free rapid quenching technique for yeast metabolomicsJ. Metabolomics, 2008, 4(3): 226-239. 22. Jensen NB, Jokumsen KV, Villadsen J. Determination of the phosphorylated sugars of the Embden-Meyerhoff-Parnas pathway in Lactococcus lactis using a fast sampling technique and solid phase extraction J. Biotechnology and Bioengineering, 1999, 63(3): 356362. 23. Villas-Bas S G, Bruheim P. Cold glycerolsaline: The promising quenching solution for accurate intracellular metabolite analysis of microbial cellsJ. Analytical biochemistry, 2007, 370(1): 87-97. 24. Spura J, Christian Reimer L, Wieloch P, et al. A method for enzyme quenching in microbial metabolome analysis successfully applied to gram-positive and gram-negative bacteria and yeastJ. Analytical biochemistry, 2009, 394(2):192-201 25. Mengin-Lecreulx D,Flouret B,van Heijenoort J.Pool levels of UDP N-acetylglucosamine and UDP N-acetylglucosamine-enolpyruvate in Escherichia coli and correlation with peptidoglycan synthesisJ.J Bacteriol,1983,154:12841290 26. De Koning W,Van Dam K.A method for the determination of changes of glycolytic metabolites in yeast on a subsecond time scale using extraction at neutral pHJ.Anal Biochem,1992;204:118123 27. Zaldivar J,Borges A,Johansson B,et al.Fermentation performance and intracellular metabolite patterns in laboratory and industrial xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiaeJ.Appl Microbiol Biotechnol,2002,59:436442 28. Maharjan R P,Ferenci T.Global metabolite analysis: the influence of extraction methodology on metabolome profiles of Escherichia coliJ.Anal Biochem,2003,313: 145154 29. Villas-Boas S G,Rasmussen S,Lane,G A.Metabolomics or metabolite profiles.J.Trends Biotechno,2005,23(8):385386 30. Monton M R N, Soga T.Metabolome analysis by capillary electrophoresis-mass spectrometryJ.J Chromatogr A,2007,1168:237246 31. Villas-Bas S G,Delicado D G,Nielsen J,et al.Simultaneous analysis of amino and nonamino organic acids as methyl chloroformate derivatives using gas chromatography-mass spectrometryJ.Anal Biochem,2003,322:134138 32. Koek M M,