生物技术在药用植物育种上的应用.ppt

第九章 生物技术在药用植物育种中的应用,第一节 细胞工程育种 第二节 基因工程育种 第三节 分子标记辅助育种,生物技术是二十一世纪的战略技术，有人分析预测，到2100年生物技术将成为推动世界经济增长的主要技术动力，并在技术、经济、社会活动中扮演重要角色，同时也将在医药业、农业、食品制造、化工、环保、新能源以及传统产业改造升级等方面大放异彩，届时，生物技术将同信息技术一样，遍布人们生活的方方面面，并且将使世界的经济及社会产生根本性的变化。因此，世界各国都将生物技术作为战略性技术重点大力推动发展。目前世界上正在形成一条“以资源为基础，以基因为核心，以品种为载体”的生物技术产业。,面对许多野生的药用植物濒于灭绝，一些特殊环境下的药用植物引种困难等问题，生物技术在药用植物育种上的应用研究已成为当今中药研究的热点，如育出了茎尖地黄新品系，已在产区应用，并将使传统中药进入一个崭新的时代。,什么是生物技术？,生物技术（Biotechnology ）：,Bio Biology Technology Application,The application of Biology for the benefit of humans,What is Biotechnology ?,Traditional/old biotechnology The conventional techniques that have been used to produce beer, wine, cheese, many other food.,Beer, Bread, and Wine Making are Centuries Old.,Ancient Egyptian drawing of a cylinder seal impression on a jar stopper bearing the name of Khasekhemwy, a Dynasty 2 pharoah. It shows a grapevine trained to run along a trellis or arbor. (around 2700 b.c.),远古人类发现，吃剩的米粥数日后变成了醇香可口的饮料-人类最早发明的酒,微生物发酵,New/modern biotechnology All methods of genetic modification by recombinant DNA and cell fusion techniques, together with the modern development of traditional biotechnological process.,组织培养,Micropropagation,白菜,甘蓝,白菜甘蓝,体细胞杂交,基因工程重组乙肝疫苗,基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。,通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取420mg干扰素，若从人血中提取干扰素，300L血才提取1mg！,人造血液及其生产,Science Vol. 222, Nov. 1983,Time Magazine, March 1997,1983 SCIENCE Cover Transgenic Mice 1997 TIME Cover - Dolly,“黄金”大米,通过转基因技术，转化胡萝卜素合成酶基因，使大米富含胡萝卜素，从而解决人们缺乏维生素A的问题，而大米也成了金黄色的“黄金大米”。,转基因技术,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,S sensitive plants R resistant plants,PCR-RFLP marker linked to nematode resistance gene Mi,分子标记辅助育种,Biotechnology: A collection of technologies,The Applications of Biotechnology,Medical Biotechnology Diagnostics Therapeutics Vaccines Agricultural Biotechnology Plant agriculture Animal agriculture Food processing Environmental Biotechnology Cleaning through bioremediation Preventing environmental problems Monitoring the environment,第一节 细胞工程育种,植物细胞工程 指以植物细胞为操纵对象，在体外进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育植物个体或获得某种有用物质的过程。 一、植物离体培养技术 二、体细胞变异及突变体筛选 三、原生质体培养和体细胞杂交 四、染色体工程,一、离体培养技术（in vitro culture）,植物细胞的全能性（Cell Totipotency） 一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力称之为细胞的全能性。 即广义的组织培养，是现代生物技术的一个重要组成部分，它是指运用无菌操作技术，将从植物体分离的符合需要的组织、器官或细胞（包括去壁后的原生质体）等，接种在人工培养基上，置于人工控制的环境条件下进行培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其它生物产品的技术。,切取,接种,愈伤组织的形成,分化形成小芽或根,试管苗的形成,移栽,植物离体培养主要包括： 1、胚珠和子房培养 2、离体胚的培养 3、组织或愈伤组织培养 4、细胞培养 5、原生质体培养,离体培养技术在药用植物育种上的应用,1、种质创新,克服远缘杂交障碍获得远缘杂种 远缘杂交的障碍： 杂交不亲和性（cross-imcompatibility） 试管授粉受精 杂种不育性（hybrid invability） 幼胚培养和胚胎拯救、体细胞融合 杂种不稔性（hybrid infertility）,获得体细胞杂种（ somatic hybrid ） 体细胞杂交可以获得通过有性杂交不能获得的属间或种间杂种，转移胞质遗传性状（如雄性不育性）以及非豆科作物转移固氮基因，或高光合效率的基因转移。,A somatic hybrid (center) between cultivated potato (left) and wild species (right).,突变诱发与体细胞无性系筛选 体细胞无性系变异（somaclonal variation）是选择变异的一个重要来源。为了筛选出特殊的突变类型，可以把某种选择因素结合到培养基或环境逐个进行筛选。通过这一途径，已分离出广谱的变异细胞系，如抗药物、抗除草剂、抗病、抗不良环境条件细胞系，从而成功进行离体选择,Example of somaclonal variation; a dwarf banana after micropropagation,Carrot family lines regenerated from tissue-culture. Both have been grown for 12 weeks in a glasshouse after 10 weeks vernalisation. Family 16 (LHS) are flowering abundantly, while Family 17 (RHS) have not flowered.,遗传转化受体系统,进行高效遗传转化的前提是建立良好的离体再生系统。以原生质体、叶片或愈伤组织等外植体作为受体进行遗传转化，培养出转基因植株，在作物改良上具有巨大的潜力,倍性育种（胚乳培养、花药培养）,利用花药及花粉培养进行单倍体育种，将优良的单倍体进行染色体加倍，便可迅速地获得纯合的二倍体，从而加速亲本材料的纯化。三倍体植物也可通过胚乳培养再生植株的途径获得。,单倍体育种程序： 材料采集 接种培养 诱导愈伤组织 获得再生植株 染色体加倍 幼苗培育和品种选择,2、无病毒苗木繁育,对于无性繁殖植物感染病毒引起退化的品种可以通过分生组织培养或再结合如热处理等其它处理，有效地进行脱毒，从而获得了脱毒苗。 如马铃薯、大蒜、草莓、甘薯等,脱毒,3、种质资源保存,中国农业科学院国家种质资源库,利用茎尖培养结合低温或超低温冷冻贮藏来保存种质资源，特别是对一些无性繁殖作物的种质资源保存更有价值。它不仅节约空间，又可减少病虫为害，也便于运输利种质资源的交换。,4、生产人工种子,种皮,胚芽,胚根,现在已有胡萝卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡胶等几十种植物的人工种子试种成功。,胚乳或子叶,二、体细胞变异与突变体的筛选,1、体细胞变异及突变体类型 Larkint Scowcroft把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系，而把这些植株所表现出来的变异称为体细胞无性系变异。 植物细胞在离体培养过程中，细胞、愈伤组织以及再生植株因各种外部因素的影响可能会发生一定频率的变异。发生了可遗传变异的体细胞或再生植株等个体称为突变体。 突变体类型： 抗性突变体 不育性突变体 营养缺陷型突变体 形态特征和生物学特性突变体,体细胞突变体的诱发和筛选,材料选择 目标性状明确；细胞培养技术可行；细胞类型适当 突变诱发 采用物理或化学人工诱变 突变体筛选 直接筛选法，间接筛选法 突变体鉴定 筛选后先转移到非选择培养基上，再转到分化培养基上再生植株，最后利用各种手段检测突变体的表达及遗传稳定性。,三、药用植物原生质体培养和体细胞杂交,原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞,胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。,植物原生质体培养是指将植物细胞去壁后，放在无菌条件下，使其进一步生长发育的技术。,目前，药用植物原生质体（protoplast)培养已获得成功的包括夹竹桃科、五加科、紫草科、菊科、葫芦科、龙胆科、豆科、毛茛科、茄科、玄参科、伞形科、天南星科和百合科的数十种植物。,1、原生质体培养的意义：,PROTOPLAST ISOLATION AND PURIFICATION,2、原生质体的分离 植物细胞具有细胞壁，获得大量有活力的原生质体，需要设法去掉细胞壁。材料的来源一般采用叶肉、茎尖或液体悬浮培养的细胞，在有合适的渗透稳定剂溶液中（如在高渗的蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇溶液），运用分离细胞和降解细胞壁的酶（如果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等）混合处理，进行原生质体分离。,影响原生质体分离的因素： （1）材料来源： 叶肉细胞是常用的材料， 其次为愈伤组织或细胞悬浮培养物。此外 , 从根、茎、叶、花、果实、胚芽鞘、子叶、花粉、四分体等均能分离原生质体。 （2）渗透压： 原生质体分离之前必须确定一个适合的渗透压。 CPW溶液甘露醇或蔗糖调节，维持较高的渗透压。 （3）酶 植物细胞壁结构复杂 , 由纤维素和半纤维素组成 , 需要一定的酶组成才能降解它。 （4）分离培养基。 钙离子、镁离子和PO43- 等对原生质体的活力保持很重要， （5）培养条件酶处理时的温度和 pH 最重要。 PH 缓冲剂MES，PH范围4.8-7.2 （6）组织前处理 高渗前处理、激素处理、低温处理、激素与低温结合前处理等对不同植物原生质体分离可能有较好的效果。,3、原生质体培养,原生质体培养前必须调到一定密度，一般 103105/ml 的密度比较适合原生质体培养。原生质体的培养方法各种各样，依药用植物和材料来源而异。 平板培养 液体浅层培养 悬滴培养 液、固双层培养 琼脂糖包埋 看护培养等,影响原生质体培养的因素 培养基： 基本培养基、生长调节剂、有机附加物等 物理条件： 密度、光照和温度等都会影响培养效果。 低于一定密度原生质体不能分裂，一般认为大群体的原生质体有利于将培养基中原生质体在培养过程中释放的有害物质脱毒。原生质体培养一般在暗处进行，有利于壁形成和细胞再生，有的物种一直在暗处直到形成愈伤组织，有的一周后移到光下。照光与否以及什么时候照光，光强如何，均直接影响着植板率。 植板率的计算公式如下： 植板率=形成小愈伤块个数/接种时细胞总数100%,4、体细胞杂交（somatic hybridization） 也称原生质体融合（protoplast fusion），是在离体条件下将同一物种或不同物种的原生质体进行融合培养并获得杂种细胞的再生植株。,体细胞杂交的意义： 克服了植物种属间生殖障碍，为新种质的创造提供了一条有效途径。 用于转移母性遗传性状，如分别由叶绿体和线粒体基因控制的不同的除草剂阿特拉津抗性和雄性不育性状等。利用非对称融合技术，将采用X-射线处理抑制核活性的雄性不育系（供体），与用碘乙酰胺处理抑制胞质活性的受体进行原生质体融合，获得具有雄性不育性状的二倍体胞质杂种，而且雄性不育性状可稳定地遗传。,植物体细胞杂交的过程,愈伤组织,杂种植株,原生质体的融合方式 自发融合（spontaneous fusion） 当酶降解细胞壁时，常常可以发现相邻的同源原生质体融合在一起形成同核体（homokaryons），即自发融合。这种自发融合的每一个同核体中可以发现有240个核。当利用正处于活跃分裂的培养细胞制备原生质体时，更容易出现这种多核融合体。 诱导融合（induced fusion）两种。 化学融合 电融合,化学融合 多采用高分子量的（1500 6000MW）2850的聚乙二醇（PEG）处理，两个不同物种的异源原生质体就会形成粘连的团聚体，然后再用高钙、高pH的溶液处理，形成异核体（heterokaryons）。 电融合 主要步骤是：原生质体悬浮液在两极间施加高频交流电场（一般为0.41.5MHz，100250V/cm），使原生质体偶极化而沿电场线方向泳动，并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链；再用一次或多次瞬间高压直流电脉冲（一般为310s，13KV/cm）来引发质膜的可逆性破裂而形成融合体。,Potato leaves suspended in wall-dissolving enzyme solution,Protoplasts float to top in sugar solution,Potato leaf protoplasts immediately after digestion of cell walls,叶肉细胞经酶解去壁获得原生质体,Freshly isolated potato protoplasts,Two protoplasts ready to fuse together,Fusion products begin to divide on nutrient medium,small shoots emerge from the green calli,Putative somatic hybrid plants,S. bulbocastanum,Somatic hybrid,Potato,四、染色体工程,按照特定目标，通过对染色体操纵，来改变染色体的组成，并进而改变其遗传特性的过程叫染色体工程。通常包括倍性育种（单倍体与多倍体育种）、体细胞杂交、染色体的遗传操作（异附加系、异代换系等）以及染色体微切割、人工染色体等。此处仅就染色体微切割、人工染色体作一介绍。,1染色体微切割、微克隆 染色体微切割（microdissection）、微克隆（microcloning）是指在显微镜下利用特种工具，对特定染色体片段进行微切割加工，并从分离相中分离出来，进行DNA体外扩增并克隆到载体中以构建特定染色体区段、特异性DNA文库的技术。 该技术首先在动物及人类遗传中建立，1991年首次应用到植物中。目前已有多种植物，如番茄、柚、银杏、大豆、百合、蚕豆等的染色体显微分离、文库构建与特定序列的克隆。 目标染色体分离克隆的前提是高质量的染色体制片。染色体大小、臂比、随体有无等形态特征是识别染色体的最常用的依据。端着丝粒染色体形态独特，无需分带和荧光染色即可在有丝分裂中期加以辨认，因而是理想的微切割材料，可提高分辨率、准确性，也可通过分带或荧光原位杂交等技术加以鉴别。,微克隆方法有两种； 一是酶解直接克隆法，目标染色体片段经蛋白酶裂解后提取出目标片段DNA，由于目标染色体DNA的量很少，最初的染色体微切割需切割分离大量染色体（100200条）； 另一是PCR介导克隆法，PCR技术的应用大大促进了染色体微切割、微克隆技术的发展。单条染色体经内切酶消化后，在DNA片段两端加接头，接头内可包含根据克隆需要而设计的内切酶位点，并根据接头序列设计引物进行PCR扩增。扩增产物可进行微克隆、构建成染色体或染色体片段DNA文库。 目前染色体微切割仍局限于构建特定染色体和特定染色体片段的DNA文库。这种文库可用来筛选目标基因的候选克隆，也可以从中筛选对某个染色体区段有特异性的探针，这些探针属于同一连锁群，因而可用来构建高密度分子标记连锁图，进行YAC、BAC文库筛选。,2人工染色体 真核生物染色体呈线状，着丝粒、端粒和复制起始点是真核生物染色体的最基本的组成元件。,1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。,酵母人工染色体（Yeast artificial chromosome ，YAC） YAC载体的基本组成部分： * 一段来自酵母染色体的着丝粒序列（CEN）； * 一段控制酵母DNA复制的自主复制序列(autonomously replicating sequence, ARS) * 一对酵母的端粒序列，有的载体中（如pYAC4）来自四膜虫染色体； * 选择记号； * 克隆位点,第一个酵母人工染色体Murray和Szostak（1983）在大肠杆菌质粒pBR322基础上加入酵母着丝粒，ARS及四膜虫的核糖体RNA基因末端（Tr，其结构和功能与端粒DNA相似）及基因，总长度为10.7kb。 YAC是基因工程的主要载体和基因组分析的有力工具。现已构建了人、牛、猪、绵羊、小鼠、果蝇等动物以及拟南芥、玉米、番茄、大麦、甜菜、水稻和马铃薯等植物YAC文库。,细菌人工染色体（BAC） 细菌人工染色体是以大肠杆菌F因子为基础构建的，具有F因子遗传稳定的优点，可负载小于350kb的DNA片段。BAC的环状形式存在于E.coli中，在宿主菌中能稳定遗传，没有缺失，重组和嵌合现象，转化效率高，极大方便了目的基因筛选。目前已构建了人、牛、鼠、鸡、水稻、高粱等生物的BAC基因组文库。,优点：能携带大片段DNA，约300kb。 在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。 缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A, part B）。每个E coli能接受 300kbDNA片段。,细菌人工染色体（BAC）,第二节 基因工程在药用植物育种中的应用,基因工程是分子遗传学和工程技术结合的产物，是现代生物技术的核心。它能按人类需要，把遗传物质DNA分子从生物体中分离出来，进行剪切、组合、拼装，合成新的DNA分子，再将新的DNA分子植入某种生物细胞中，使遗传信息在新的宿主细胞或个体中得到表达，以达到定向改造或重建新物种的目的。,植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、基因遗传转化技术及植物组织培养技术的发展而兴起的生物技术。 可定向改造遗传性状； 打破物种间生殖隔离障碍； 在药用植物重要性状的遗传改良、抗逆抗病育种、品质改良与种质创新等方面发挥着日益巨大的作用。,转基因食品(Genetically modified foods，GMF，又称基因修饰食品或基因改良食品)，系指利用基因工程技术改变基因组构成的动物、植物和微生物生产的食品和食品添加剂。,GMO 是genetically modified organisms 的缩写，指通过基因工程改造的生物。,常听到的几个名词,Crops available that have been genetically modified,Corn Soybeans Cotton Canola Cauliflower,Tomato Sugarbeet Papaya Potato Cabbage,Not available for commercial production,Wheat Barley,Grapes Bananas,Pineapple Carrots,Alfalfa Tobacco Sugarcane Rice Peppers,Onion Celery,2001年转基因植物种植面积比例,大豆63%,油菜 5%,棉花 13%,玉米 19%,Transgenic plants were first created in the early 1980s by three groups working independently. Subsequent research has developed transgenic plants with commercially useful traits such as resistance to herbicides, insects, and viruses.,83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02,First transgenic plant,Delay-ripening tomato Commercialized in the US,First field tests 6/92,Herbicide resistant, insect resistant plants commercialized,GM maize approved by EU,First Bt corn plants 6/90,Rotting resistant tomato approved by FDA,转基因植物发展简史,基因工程主要步骤： （一）目的基因的获取 （二）植物表达载体的构建 （三）遗传转化 四、转化细胞筛选及转基因植株鉴定 五、外源基因整合及表达分析 六、转基因作物新品种选育,Exogenous genes (non-plant genes),（一）目的基因的获取,1、目的基因的来源,Endogenous genes (Plant genes),（1）化学合成 （2）筛选基因组文库或cDNA文库 （3）PCR方法（ Polymerase Chain Reaction ） （4）图位克隆（map-based cloning）与染色体步移 （chromosome Walking） （5） 酵母双杂交体系Two-hybrid system,2、目的基因的获得,（1）化学法直接合成基因,针对已经知道序列和分子结构的基因，在实验室进行人工合成。 1977年，K. Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。,早期通过化学合成的部分基因,基因 人胰岛素 转运RNA -干扰素 肠促胰液肽 尿抑胃激素 -干扰素,大小（bp） 126 542 81 162 453,合成年代 1978 1979 1981 1982 1982 1984,基因 视紫红质 前脑菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶T1 RNA酶,大小（bp） 1057 77 170 385 324 375,合成年代 1985 1985 1985 1985 1986 1987,（2）通过筛选基因组文库和cDNA文库克隆目的基因,基因组DNA文库（genomic DNA library） 指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片断，克隆到某种载体上而形成的集合。,基因组DNA,DNA片断,连接克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶酶切,受体菌,cDNA文库 (complementary DNA library ，cDNA) 指生物某一发育时期或某一特定组织所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片断与某种载体连接而形成的克隆的集合。,从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。 大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。 如菌斑杂交法(plaque hybridization)筛选噬菌体核基因库。,（3 ）通过聚合酶链式反应（PCR）方法克隆,使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物 。,PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。,加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列； （2）与被分离的目的基因两条链 各自5端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）； （3）TaqDNA聚合酶； （4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。,聚合酶链式反应（PCR）,变性、退火、延伸三步曲,变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,聚合酶链式反应（PCR）,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段,基于PCR方法克隆目的基因的方法如： mRNA差别显示技术（DD-PCR） RT-PCR RACE分离cDNA全长 TAIL-PCR 代表性差异分析（cDNA RDA） 抑制消减杂交法（SSH）,(4)图位克隆和染色体步移方法分离目的基因,染色体步移(chromosome walking) 是通过逐一克隆来自染色体基因组DNA 的彼此重复的序列,而慢慢的靠近目的基因开始步移的克隆可以是已知的基因、RFL Ps、RAPDs 或其它已鉴定的分子标记,用它来杂交筛选大片段DNA 文库中的阳性克隆,这样就得到了“一步”克隆,进一步的走步工作需要新的杂交探针, 利用新获得的探针对文库进行第二次杂交,得到了与探针具重复序列的阳性克隆,称为“二步”克隆,理论上讲,这就向前步查了两步。远距离的目的基因通过这样周而复始的查步而获得。,（5）通过酵母双杂交方法克隆目的基因,酵母双杂交技术的基本原理,（二）植物表达载体的构建,在植物基因转化过程中，已建立了多种转化系统，如载体转化系统，原生质体转化系统，DNA直接导入转化系统，基因枪导入转化系统，花粉管介导转化系统等，但载体转化系统是目前使用最多、技术最成熟、成功实例最多的一种转化系统，也是植物基因工程最重要的一种转化系统，因此所谓植物基因工程载体主要是指这一类载体，它具体包括Ti质粒转化载体、Ri质粒转化载体及病毒转化载体，其中Ti质粒转化载体是最主要的。,cause Crown gall disease,A natural DNA delivery system,Agrobacterium tumefaciens,Agrobacterium is a natural genetic engineer i.e. it transfers some of its DNA to plants,A plant pathogen found in nature,Infects many plant species,Delivers DNA that encodes for plant hormones,DNA incorporates into plant chromosome,Hormone genes expressed and galls form at infection site,Auxin, cytokinin, opine synthetic genes transferred to plant Plant makes all 3 compounds Auxins and cytokines cause gall formation Opines provide unique carbon/nitrogen source only A. tumefaciens can use!,天然Ti质粒的主要功能基因：,用于天然的Ti质粒必须要进行改造，才能用于基因工程，有几个重要问题必须解决： Ti 质粒太大，很难进行分子生物学操作； 在大肠杆菌中要易于操作； 转化植物后，能够易于筛选，不能有致瘤性； 单一的限制性内切酶位点，以便外源基因的插入T-DNA中。,天然Ti质粒和工程改造Ti质粒的差异,包括选择标记基因、报告基因和目的基因,一些常见的遗传选择标记和报告基因 （Reporter Genes/Selectable Markers）,Neomycin Phosphotransferase gene(nptII) 抗卡那霉素 Hygromycin(hpt) 抗潮霉素 Phosphinothricin(bar) 抗除草剂 GUS -glucuronidase enzyme which converts colorless substrate to blue product 葡萄糖苷酸酶基因 Luciferase (firefly) GFP 绿色荧光蛋白基因,目前主要采用两种质粒基因转化载体系统，一元载体系统和二元载体系统，目前在植物转化中大多是二元载体系统。,Co-integrative 一元共整合载体,Binary vector 二元载体,LB,RB,用于植物转化的工程质粒pCAMBIA1300图谱,pB19hpc (Golden Rice Cassette),用以转化的载体部分结构。,（三）植物遗传转化方法,1、农杆菌介导的遗传转化 2、基因枪介导的遗传转化 3、花粉管通道法,1、农杆菌介导的植物遗传转化,农杆菌介导法植物转基因的原理 Agrobacterium-mediated plant transformation,Agrobacterium tumefaciens mediated plant transformation,农杆菌介导的植物遗传转化必须具备2个前提： 1、植物能够被农杆菌侵染 单子叶不易侵染，双子叶植物容易侵染。 2、植物比较容易再生,regenerable cells,Transformed cells,Cells containing new DNA that are able to regenerate into a new plant,2、基因枪转化法(biolistics),uses a gene gun DNA is coated onto gold (or tungsten) particles (inert) gold is propelled by helium into plant cells if DNA goes into the nucleus it can be integrated into the plant chromosomes cells can be regenerated to whole plants,The Gene Gun,PDS1000 Microparticle Delivery System,Helium chamber,Rupture disk,Macrocarrier,DNA coated gold particle,Stopping screen,Focusing device,Target tissue,基因枪转化方法在单子叶植物如玉米、水稻等用的较多。,（四）转化细胞的筛选及转基因植株鉴定,1、抗性筛选 2、报告基因 3、核酸杂交 4、PCR检测,转基因水稻根、茎和叶的GUS组织化学分析,A,B,C,a,b,c,a,b,c,a,b,c,A, 根系； B, 茎杆；C, 叶片。a, Gus 基因由35S启动子驱动； b, Gus 基因由蔗糖合酶基因RSuS1的启动子序列驱动； c, 未转基因水稻植株。 A, roots; B, stems; C, leaves. a and b represent the Gus gene is drived by 35S and RSuS1 promoter respectively; c, no-transformed plants as negative control.,以GFP为报告基因的转基因植株和气孔,Southern Blot,Begin by cutting DNA of putative transgenic plant into fragments with Restriction Enzymes. Run DNA on an agarose gel “Blot” onto a membrane Probe membrane Autoradiography,+ve,-ve,P32 labelled probe,2.0kb,1.0kb,0.5kb,转基因植株中Gus基因的PCR检测 PCR analysis of Gus in putative transgenic plantlets M, DNA marker; P, 以PCAM-Gus1质粒为阳性对照; CK1,以水为模板的阴性对照; CK2,以未转基因植株为阴性对照; 1-6，转基因植株。 M, DNA marker; P, PCAM-Gus1 plasmid as positive control; CK1,the templete is water as negtive control; CK2, non-transformed plantlet as negative control; 1-6, putative transgenic plantlets.,M P CK1 1 2 3 4 5 6 CK2,(563 bp),（五）外源基因的整合及表达分析,通常外源基因在受体植物染色体上是随机插入。也有一些报告表明有时特定的外源基因插入位点在序列上有一定的倾向性，并不完全随机。外源基因插入植物染色体的拷贝数差异较大，插入过程中可能会发生结构变化。 外源基因在转化体中的表达可以通过Western杂交和ELISA分析来检测。,Western Blot,Highly specific qualitative test Can determine if above or below threshold Typically used for research Use denaturing SDS-PAGE Solubilizes, removes aggregates & adventitious proteins are eliminated,Components of the gel are then transferred to a solid support or transfer membrane,Paper towel,Transfer membrane,Wet filter paper,Paper towel,weight,三种印迹技术的比较,ELISA,采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。,Colour Response Concentration Dependent,（六）转基因植物新品种的培育,植物转基因育种可以通过转基因方法直接培育出优良新品种，包括外源目的基因直接导入优良推广品种或品系以改良个别性状，或者是将转基因植物作为亲本材料在作物品种培育过程中间接利用。 植物基因工程育种与常规育种是相辅相成的，基因工程必须与常规育种密切配合，通过杂交或回交育种手段，经大田试验，从而加快优良新品种（系）的培育进程。,二、转基因技术在育种上的应用,1. New horticultural varieties Understand the anthocyanin (pigment) biosynthetic pathways, can produce novel flower varieties,2. Improve pest resistance Transfer gene that inhibits digestion of starch (amylase inhibitor) from bean to garden pea Stops attack by weevils Transfer one of many Cry genes from Bacillus thuringiensis to plants Makes protein (Bt) toxins, only small amount needed in plant to kill insect pests,Transfer viral coat proteins to plants to make them more resistant to viral attack tobacco mosaic virus Papaya ringspot virus Potato X and Y viruses,Bollgard cotton,Nontransgenic control,Nontransgenic control,Virus resistant potato,Nontransgenic control,Weevil resistant peas,Ringspot virus resistant papaya,Susceptible plants,EPSP synthase,2. Improve pest resistance (contd) Transfer mutated gene in shikimic acid pathway from E. coli to make resistant (Roundup Ready) plants Glyphosate herbicides inhibit an important enzyme in this pathway; plants need aromatic AAs to grow!,3. Improve nutritive value of plants Use metabolic engineering to insert new pathways into plants or improve expression of enzymes in existing ones.Most crop plants are deficient in one or more amino acids maize is low in lysine, methionine and tryptophan Improve vitamin quality of crops “Golden rice” higher in beta-carotene, the precursor to vitamin A Improve value of feed crops Transfer a fungal enzyme (phytase) to crops to remove phytic acid from feed and improve phosphate availability,4. Improve resistance to stress e.g., salt stress: Express high levels of Na+/H+ antiporter in vacuole membrane This allows plants to grow in high Na (50X normal limit) because they sequester excess If transporters known, can also be used to engineer plants to phytoremediate toxic soils,Control tomatoes at 200 mM NaCl,Transformed tomatoes at 200 mM NaCl,5. Improve postharvest physiology of fruits and vegetables Delay fruit ripening: slow down the ethylene response of the ripening pathway, allowing fruit to be picked ripe on the vine,Flavr Savr tomato blocked polygalactonurase synthesis by antisense: degrades plant cell wall pectin,6. Grow high