预防医学]毒理chapter6-115版.ppt

1,第六章,外源化学物的一般毒性作用,环境卫生与毒理学教研室 李宏辉,2,掌握： 基本概念、试验目的、急性毒性试验设计、LD50的计算方法及急性毒性分级； 熟悉： 急性毒性替代试验的方法、局部刺激试验的方法、蓄积毒性、亚慢性毒性、慢性毒性试验设计； 了解: 化学毒物所致的病理学改变及其评价。,教学目标和要求,3,概 述,什么是外源化学物？,什么是外源化学物的一般毒性作用？,4,一般毒性作用：,也称为基础毒性，是全身各系统对外源化学物的毒作用反应。,5,特殊毒性作用,致畸作用,致癌作用,致突变作用,6,为什么要研究外源化学物的一般毒性作用？,7,Section 1,急性毒性作用 （acute toxicity）,8,健康相关产品毒理学评价阶段与试验项目,acute toxicity:是指机体（实验动物或人）一次或24小时内接触多次一定剂量外源化学物后在短期内所产生的毒作用及死亡。,一、急性毒性的概念,概念的解释：,经口、注射器染毒，瞬间给予； 经呼吸道、皮肤染毒，一段时间。 24小时内多次接触：外源化学物毒性很低。 短期内：最长的观察期限为14天。,一次：,获得急性毒性参数：LD50、LD100、LD0等； 初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量-反应（效应）关系和对人体产生损害的危险性；,二、急性毒性试验的目的,12,为重复剂量、亚慢性和慢性毒性试验等后续试验提供接触剂量设计依据，并为观察指标的选择提出建议； 为毒理学机制研究提供初步的线索。,经典急性毒性试验设计： 急性毒性替代试验： LD50应用中的有关问题： 急性毒性分级和评价：,三、急性毒性试验方法的要点,14,（一）经典急性毒性试验的设计,实验动物,染毒途径,试验周期与毒效应观察,染毒剂量与分组,15,选择的原则： 选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的实验动物； 品系纯化； 价格较低和易于饲养和获得。,实验动物的选择,16,实验动物的选择,实验动物的种属和品系； 实验动物的年龄和体重； 实验动物的性别； 动物数量； 实验动物的预检； 禁食。,17,实验动物的选择,1.实验动物的种属和品系： 种属： 最好用两种种属的动物 啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔； 非啮齿类：狗或猴。 大鼠为首选的啮齿类动物。,18,实验动物的选择,品系：起源于共同祖先的一群动物。 依据遗传学背景分类： 近交系 （Inbred strain） 杂交群 （Hybrid strain） 封闭群（Closed colony），如：昆明种小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠等。,19,实验动物的选择,2.实验动物的年龄和体重：,同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20。,20,实验动物的选择,3.实验动物的性别： 雌雄各半； 化学毒物对雌、雄动物的毒效应有明显差异时； 致畸试验，可仅作雌性动物的LD50测试； 实验动物必须是未曾交配和受孕的动物。,21,实验动物的选择,4.动物数量与分组 大、小鼠等小动物-每组10只 狗等大动物-每组6只 几组？,22,实验动物的选择,动物分组： 改进寇氏法至少设5个剂量组； 概率单位图解法一般设610组； 霍恩法设4个剂量组； 分组方法： 随机分组。,23,实验动物的选择,5.实验动物的预检： 通常情况下观察57天，剔除异常的动物，选择健康动物； 检疫期与实验期雌雄动物分笼饲养，防止交配及受孕。,24,实验动物的选择,6.禁食： 大鼠应隔夜禁食； 小鼠应禁食4h； 大动物可在染毒前不喂食，染毒后继续禁食34h； 要保障饮水的供应。,25,选择的原则： 模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式； 有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较； 受试物的性质和用途； 各种受试物毒性评价程序的要求等。,染毒途径的选择,26,染毒途径的选择,最常用的染毒途径为： 经口； 经呼吸道； 经皮肤； 注射途径。,27,染毒途径的选择,经口染毒：灌胃、喂饲、吞咽胶囊； 经呼吸道：吸入染毒、气管内注入； 经皮肤染毒：动物背部皮肤、小鼠浸尾法； 注射途径:腹腔注射、静脉注射、肌内注射、皮下注射。,28,染毒途径的选择,各种染毒途径都有一个最大染毒容量的问题： 小鼠一次灌胃体积0.21.0ml/只； 大鼠一次灌胃体积1.04.0ml/只； 豚鼠一次灌胃体积1.05.0ml/只；,29,了解理、化性质,染毒剂量及分组,预实验,正式试验,查阅文献,30,1.查阅文献,有相关毒性资料可供参考者； 没有相关毒性资料可供参考者,31,（1）有相关毒性资料可供参考者,找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料 ，以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50值作为受试化学物的预期毒性中值。 设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计12个剂量作为预试验剂量。,32,（2）无相关毒性资料可供参考者,以最大耐受量作为实验的最高剂量 ； 以1mg/kg为最低剂量组 ，组距为4，进行预实验。,33,2.预试验,找出10%90%或0%100%致死剂量的范围，然后在这个剂量范围内以合适的间距设几个剂量组，作为正式试验的剂量。,34,3.正式试验,组数的确定： LD50的计算方法： 改进寇氏法（karbers method） 序贯法（sequential method） Bliss法 霍恩法（Horn）,35,改进寇氏法至少设5个剂量组； 概率单位图解法一般设610组； 霍恩法设4个剂量组； 设立对照组； 采用随机化分组的方法。,36,可根据以下公式计算出组距 i 值： i= (lgLD90- lgLD10)/(n-1) 或i= (lgLD100- lgLD0)/(n-1) 式中： i为组距（相邻两个剂量组对数剂量之差） n为设计的剂量组数,37,剂量分组,求得 i 值后，以最低剂量组（ lgLD0或 lgLD10 ）的对数剂量加上一个i，既是第二个剂量组的对数剂量，依次类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。,38,毒效应的观察,观察期限： 一般为14天； 也可依据毒性反应、症状发生的速度和恢复期的长短而定。,39,毒效应的观察,急性毒性试验的观察和记录内容主要包括： 中毒体征及发生过程； 体重和病理形态学变化； 死亡情况和时间分布。,40,1.中毒体征及发生过程,试验过程应详细地观察和记录动物出现的中毒症状、发生的时间、症状发展的经过，死亡前的特征以及死亡时间等。,41,42,2.体重和病理形态学变化,体重的变化： 病理形态学变化：对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查。 根据实验目的可增加检测指标：体温、心电图、电图或进行某些生化指标测定等 。,43,3.死亡情况和时间分布,重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。,44,表 急性毒性实验原始记录,45,LD50的计算方法,以改进寇氏法为例： 本法要求每个染毒剂量组动物数要相同，个剂量组距组距呈等比级数，死亡率呈正态分布，要求最低剂量组死亡数20%，最高剂量组死亡率80%。,46,计算公式如下,m=Xk- i (p-0.5),式中： mlgLD50; i相邻两剂量组之对数剂量差值 Xk最大剂量的对数值 p死亡率 q存活率（1- p ） p各剂量组死亡率总和 n每组动物数,47,举例：小鼠经口给予某种化学毒物染毒，剂量和死亡动物数结果见表：,48,LD50的计算方法：,m=Xk- i (p-0.5) lgLD50=1.4961-0.08(2.3-0.5) =1.3521 =0.0213 lgLD50及其95%可信限为：1.35211.960.0213 LD50及其95%可信限为：？,49,又称“3R”法，即: 优化（refinement）:试验方法和技术， 减少（reduction）：受试动物的数量和痛苦， 取代（replacement）：整体动物试验的方法。,（二）急性毒性替代试验,50,固定剂量法 急性毒性分级法 上-下移动法,51,固定剂量法（fixed dose procedure）,观察终点： 不以死亡为观察终点，而是以出现“明显毒性”作为观察终点。 染毒剂量： 5、50、500mg/kg，最高限量是2000 mg/kg。,52,固定剂量法,具体方法：试验分为2个阶段进行 。 预实验阶段： 正式试验阶段：,53,固定剂量法和经典急性毒性试验的比较,毒性反应无明显差异； 毒性分级基本一致； 固定剂量法可以获得较全面的危险度评价资料。,54,固定剂量法,优点： 所用动物数少 测定一个化合物的LD50，固定剂量法平均用大鼠14.8只，经典方法平均用大鼠24.2只。 动物死亡率低。,55,急性毒性分级法（acute toxic class method ）,观察终点： 以死亡为终点； 染毒剂量： 25、200、2000mg/kg； 实验动物： 啮齿类，首选大鼠。,56,急性毒性分级法,具体方法： 从25、200、2000mg/kg3个固定剂量中选择一个剂量开始进行试验，每阶段3只动物，根据死亡动物的数量来判定大致的LD50值范围，直接进行危害评估和毒性分级。,57,急性毒性分级法,结果判断： 不需要进一步试验进行分级； 下一阶段以相同剂量的另一种性别试验； 下一阶段以较高或较低的剂量水平进行。 优点： 所用动物数少。,58,上-下移动法（up/down method）,观察终点： 以死亡为终点，但也可以观察不同的终点。 具体方法： 用1只动物序贯进行，观察48h，不死亡，下一只提高一档剂量，死亡，就降一档剂量做。但每一只存活动物都需观察至14d，后期死亡动物在统计结果时也要记为死亡。,59,上-下移动法,剂量设计： 推荐采用剂量序列1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000或5000mg/kg； 具体从哪个剂量开始，要参照已有的资料。 对于无毒性资料可以参考，推荐从175mg/kg开始。,60,上-下移动法,试验终止的条件： 设立了3种实验可以终止的判断标准，满足其中之一即应停止进一步的动物试验。 优点： 动物数量少，只需要69只动物。,61,1995年Lipnick等比较了上下法、固定剂量法和经典法，上下法和经典法一致性为23/25，上下法与固定剂量法一致性为16/20。上下法需单性别动物610只，少于另两种方法。,三种替代方法的比较,62,（三）LD50应用中的有关问题,LD50的意义 LD50的局限性,63,LD50的意义,标准化药物毒作用强度，评价药物对机体毒性的大小，比较不同药物毒性的大小； 计算药物的治疗指数，药效剂量和毒性剂量的距离； 为后续的重复给药毒理学试验剂量的选择提供参考；,64,LD50的意义,通过比较不同途径的LD50值，获得生物利用度的信息； 试验结果可用来推测人类的致死剂量以及中毒后的体征，为临床毒副反应提供监测参考。,65,LD50的局限性,获得的信息较少，实用性有限； LD50的波动性很大，影响因素很多； 物种差异对LD50影响大； 传统计算LD50的方法消耗的动物量大。,66,（四）急性毒性分级和评价,现行的各种急性毒性分级标准是以LD50值为基础划分的，而国家组织以及不同的国家都自行制定了标准。,67,表1 工业毒物急性毒性分级,我国1978年工业毒物的五级急性毒性分级标准。,68,表2 我国食品毒理急性毒性分级法(1994),1994年颁布实施的食品安全性毒理学评价程序和方法中提出的急性毒性分级的六级标准。,69,1995年颁布实施的国家标准农药登记毒理学试验方法中提出的农药急性毒性分级标准。,表3 农药的急性毒性分级,70,2003年WHO全球化学品统一分类和标签制度对多种毒性进行分级，推荐的五级标准。,表4 外源化学物急性毒性分级,71,急性毒性危害类别和急性毒性估计值(LD50或 LC50),2005年对2003年WHO全球化学品统一分类和标签制度的修订，2008年全面实施。,72,Section 2,局部刺激试验 （local irritation test）,73,局部刺激试验（local irritation test）:目的是了解外源化学物对皮肤、眼睛的局部刺激性和腐蚀性，包括眼刺激、皮肤刺激试验。 试验结果可以为制定化学物对眼睛和皮肤防护措施提供依据。,74,皮肤致敏试验可了解化学物对哺乳动物是否可以引起皮肤变态反应及其程度。 我国农药、化学品和消毒剂毒理学试验程序均规定局部刺激试验为必做项目。,75,一、眼刺激试验,眼原发性刺激试验（eye primary）:观察终点为眼刺激和眼腐蚀。 眼刺激性（eye irritation）:指眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛可逆性炎症变化。 眼腐蚀性（eye corrosion）:指眼睛前表面接触受试物后产生的眼睛不可逆性组织损伤。,76,眼刺激试验,一般对皮肤产生刺激的强酸和强碱性物质可免做眼刺激试验； 而对于PH接近中性的大部分化学物质，其对皮肤和眼的刺激性反应结果不一定有关系。,77,眼刺激试验,目前眼刺激试验推荐的方法是Draize试验，具体方法：使用白色家兔4只，每只兔的一只眼睛滴入0.1ml受试物，另一只眼睛做对照，观察眼睛结膜、角膜和虹膜的反应，按规定分级标准进行评分。 眼刺激试验一般观察期限为7天，必要时可延长观察时间到21天；,78,眼刺激评价标准,79,眼刺激试验,Draize试验以主观判断为主，故实验室内及实验室间有一定的差异。,80,二、皮肤原发性刺激试验,皮肤原发性刺激试验：包括单次和多次皮肤刺激试验，完整皮肤和破损皮肤刺激试验等。观察终点为皮肤刺激和皮肤腐蚀。 皮肤刺激（dermal irritation）:是指其皮肤接触化学物后产生的局部可逆性的炎症变化。 皮肤腐蚀（dermal corrosion）:是指皮肤接触化学物后产生的局部不可逆性组织损伤。,81,皮肤原发性刺激试验,皮肤刺激评价方法称为Draize试验。 常用的动物是家兔和豚鼠，因为这两种动物的皮肤相对较敏感； 观察时间的长短应足以观察到可逆或不可逆刺激作用，一般不超过14天。,82,皮肤原发性刺激试验,具体方法： 选择健康、成年的动物； 进行脱毛：脱毛的方法、脱毛的面积（脱毛区不可过大，为动物体表面积的10%）、脱毛的部位（背部皮肤，而不是脊柱表面的皮肤）； 染毒：涂抹好受试物后，用纱布覆盖； 试验结束后，观察涂抹部位皮肤有无充血、红斑、水肿、溃疡等表现。,83,皮肤刺激反应强度评价,84,皮肤原发性刺激试验,破损皮肤刺激试验：是认为地将动物皮肤某部位擦伤（不能伤及真皮产生出血），比较受试物对完整皮肤及受损皮肤造成的刺激反应的情况。伤口消毒用的产品常需要做破损皮肤刺激试验。,85,下列情况下，不适宜做皮肤刺激试验：,根据结构与活性关系及理化性质推测可能有腐蚀性的物质，如强酸和强碱； 在急性经皮毒性试验显示有很强的系统毒性的物质； 在急性经皮毒性试验中染毒剂量达2000mg/kg时仍未产生皮肤刺激体征的物质。,86,皮肤原发性刺激试验,影响皮肤刺激反应的因素: 皮肤的完整性； 固态受试物的物理特性； 固态受试物的溶解状态； 受试物在皮肤表面封闭染毒的严密程度； 试验的年龄、性别及受试部位的影响； 主观判断的差别； 物种的差异，皮肤反应的敏感顺序： 兔豚鼠人猪.,87,皮肤原发性刺激试验,欧盟将于2009年禁止用动物实验